SIRT1通過增強PGC-1α介導(dǎo)的線粒體發(fā)生而促進肝癌轉(zhuǎn)移的實驗研究.pdf

1、目的：
　　在明確SIRT1在肝癌中的表達模式及與臨床預(yù)后的相關(guān)性的基礎(chǔ)上，揭露SIRT1通過促進肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移而影響肝癌的預(yù)后，通過發(fā)現(xiàn)SIRT1與PGC-1α的相互作用，闡明了SIRT1通過促進PGC-1α介導(dǎo)的線粒體發(fā)生而促進肝癌轉(zhuǎn)移的新機制。
　　方法：
　　(1)收集第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院肝膽外科不同分期的原發(fā)性肝癌患者術(shù)中的肝癌組織及相鄰非腫瘤組織共72例，同時收集5例無肝病的正常肝組織，術(shù)中收集的組織部分

2、立即凍存于-80℃中，用于提取蛋白及RNA，另一部分組織用4％多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋，切片成5μm用于免疫組織化學(xué)染色。Western blot用于檢測SIRT1在肝癌組織及肝癌細胞株中的蛋白表達水平，Real Time PCR實驗檢測SIRT1在肝癌樣本中的mRNA表達水平，免疫組織化學(xué)檢測SIRT1在肝癌組織中的表達部位及強度。
　　(2)采用慢病毒轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選的方式構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌細胞株。CCK-8試劑盒用于檢測細

3、胞的活力，Cell-LightTM EdU Apollo567試劑盒檢測細胞的增殖，通過皮下移植實驗檢測SIRT1對肝癌的成瘤性的影響。
　　(3)免疫熒光染色實驗檢測EMT標(biāo)志物CK-18，vimentin，fibronectin在肝癌細胞中的表達。NAO染色和MitoTracker(@) Red CM-H2XRos探針染色實驗用于評價肝癌細胞中敲除SIRT1對線粒體質(zhì)量的影響。通過構(gòu)建肝臟原位移植模型檢測肝癌細胞中敲除SIRT

4、1和過表達PGC-1α對裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響。活體動物成像技術(shù)動態(tài)監(jiān)測肝癌形成轉(zhuǎn)移灶的部位和時間。
　　(4)統(tǒng)計分析方法:定量比較SIRT1的蛋白表達及mRNA水平在肝癌組織及相鄰非腫瘤組織中的差別采用配對t檢驗。SIRT1的相對表達水平與臨床病理參數(shù)之間的比較，根據(jù)分組的不同采用非參秩和檢驗，Spearman相關(guān)分析。而患者無病生存期和綜合生存率分別指從肝癌切除術(shù)當(dāng)天開始到患者第一次復(fù)發(fā)或者死亡的時間，采用Kaplan-Mei

5、er's分析評估SIRT1的相對表達量與患者無病生存期和綜合生存率的關(guān)系，實驗中兩組間的數(shù)據(jù)采用Student's t檢驗，而多組間的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。所有實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示，而統(tǒng)計分析采用SPSS13.0軟件進行分析，雙側(cè)檢驗P值小于0.05定義為具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　(1)SIRT1在肝癌細胞株中呈普遍的高表達相對于永生型肝細胞株L02，SIRT1在肝癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平較相鄰的非腫瘤組織明顯增

6、高(n=24，P=0.005)，而SIRT1在肝癌組織中呈普遍高表達模式，過表達率為56.9％(41/72)，而其蛋白表達水平在肝癌組織中較相鄰非腫瘤組織明顯增高(n=72，P=0.012)。免疫組化顯示SIRT1在肝癌組織中的表達水平較相鄰非腫瘤組織及正常肝組織均明顯增高，且在肝癌組織中主要位于細胞核。臨床參數(shù)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)增高的SIRT1表達水平與門靜脈癌栓形成(P=0.0039)，肝癌晚期的TNM分期(P=0.0016)密切相關(guān)，而

7、與其他病理參數(shù)無明顯相關(guān)性，如年齡，性別，HBV感染，Child-Pugh肝功能分級，肝硬化程度，血清AFP水平，腫瘤大小，Edmondson-Steiner病理分級，Milan標(biāo)準(zhǔn)。Kaplan-Meier's分析發(fā)現(xiàn)SIRT1過表達的患者較SIRT1低表達的患者有更短的無病生存期(P=0.021)和更差的綜合生存率(P=0.039)，以上結(jié)果表明SIRT1的表達水平可作為預(yù)測肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的有效指標(biāo)。
　　(2)肝癌細胞株中過

8、表達或者敲除SIRT1不影響細胞的活力或者增殖，而體內(nèi)實驗顯示在肝癌細胞MHCC97H中SIRT1敲除組與對照組顯示出相似的腫瘤細胞增殖曲線，且腫瘤體積和重量在兩組間無明顯差異。以上結(jié)果表明SIRT1的表達對肝癌細胞的增殖和成瘤性無明顯影響。肝癌細胞MHCC97中創(chuàng)傷愈合能力在SIRT1穩(wěn)定敲除組較陰性對照組明顯降低(P＜0.01)，Transwell實驗證明了敲除SIRT1顯著降低了MHCC97H細胞的遷移能力(P＜0.01)和損傷了

9、MHCC97H細胞的侵襲能力。另外，SIRT1過表達明顯增加了肝細胞株L02細胞的遷移和侵襲能力(P＜0.05)。因此，以上結(jié)果表明SIRT1的表達可增強肝癌細胞體外的遷移和侵襲能力。裸鼠尾靜脈注射實驗中，熒光信號分析顯示SIRT1敲除的MHCC97H細胞形成的全身轉(zhuǎn)移較對照組明顯減少(P＜0.01)，肝癌細胞MHCC97H在肝臟表面形成的轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)在SIRT1敲除組較對照組明顯降低(P＜0.01)，肝癌細胞MHCC97H的肺轉(zhuǎn)移發(fā)

10、生率在SIRT1敲除組較對照組明顯降低。綜上所述，SIRT1的表達可促進肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　(3)肝癌細胞MHCC97H，SK-Hep1敲除SIRT1和Huh7細胞中過表達SIRT1后，EMT上皮標(biāo)志物(E-cadherin，CK-18)，間質(zhì)標(biāo)志物(vimentin，α-SMA)和轉(zhuǎn)錄因子(snail，twi st)的蛋白表達水平無明顯變化。肝癌細胞MHCC97H敲除SIRT1對一系列EMT關(guān)鍵標(biāo)志物(E-cadherin，

11、fibronectin，vimentin，twist，and snail)的mRNA水平無明顯影響。免疫熒光染色顯示在肝癌細胞MHCC97H和SK-Hep1中沉默SIRT1的表達不能誘導(dǎo)EMT的進程。缺氧環(huán)境中肝癌細胞HepG2過表達SIRT1也不能影響EMT標(biāo)志物的表達。TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌EMT模型中，SIRT1的表達水平無明顯變化。以上結(jié)果表明SIRT1的表達對肝癌EMT的進程無明顯的影響。肝癌細胞MHCC97H在穩(wěn)定敲除SIR

12、T1后，線粒體的質(zhì)量、線粒體DNA拷貝數(shù)、線粒體DNA轉(zhuǎn)錄本(COXⅠ，ND1，ND6)、細胞內(nèi)ATP水平和線粒體發(fā)生相關(guān)基因(Tfam，COXⅣ，TOMM20)的蛋白水平均明顯降低，以上結(jié)果表明肝癌細胞中敲除SIRT1降低了線粒體發(fā)生的能力及損傷了線粒體的功能，導(dǎo)致了生物能量產(chǎn)生的缺陷。臨床標(biāo)本研究中SIRT1的過表達與PGC-1α的上調(diào)在肝癌組織相對于相鄰的非腫瘤組織存在明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.569，P＜0.001);在肝癌細胞

13、MHCC97H和Huh7中過表達SIRT1可明顯增加PGC-1α的表達水平，而MHCC97H細胞中敲除SIRT1可明顯升高PGC-1α的乙?；綇亩档土薖GC-1α的活性。而在肝癌細胞Huh7，MHCC97H中過表達PGC-1α明顯增加了細胞的遷移、侵襲能力，提高了細胞的線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體DNA編碼基因(COXⅠ，ND1，ND6)的mRNA水平，該結(jié)果表明PGC-1α促進肝癌細胞的遷移和侵襲通過增強線粒體的發(fā)生而介導(dǎo)的。過表

14、達PGC-1α明顯恢復(fù)了肝癌細胞MHCC97H因敲除SIRT1所致的降低的遷移和侵襲能力，同時，線粒體DNA拷貝數(shù)，線粒體DNA轉(zhuǎn)錄本(COXⅠ，ND1，ND6)，細胞內(nèi)ATP水平和線粒體發(fā)生相關(guān)基因(Tfam，COXⅣ，TOMM20)的蛋白水平在過表達PGC-1α而敲除SIRT1的MHCC97H組中較單獨敲除SIRT1的MHCC97H細胞組明顯增高，該結(jié)果表明過表達PGC-1α可逆轉(zhuǎn)SIRT1敲除對肝癌細胞侵襲和線粒體發(fā)生降低的抑制效

15、應(yīng)。在裸鼠原位抑制模型中，肝癌細胞SIRT1敲除組的熒光信號強度和肺組織腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量較對照組明顯降低，而過表達PGC-1α后可逆轉(zhuǎn)該抑制效應(yīng)，而來源于裸鼠轉(zhuǎn)移性肺組織的線粒體DNA拷貝數(shù)，線粒體DNA轉(zhuǎn)錄本(COXⅠ，ND1，ND6)及線粒體發(fā)生相關(guān)基因的蛋白表達水平在敲除SIRT1的MHCC97H組中較對照組明顯降低，而過表達PGC-1α后可恢復(fù)其表達水平，該結(jié)果表明PGC-1α介導(dǎo)的線粒體發(fā)生增強在SIRT1促進肝癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)

16、鍵作用。
　　結(jié)論：
　　綜上所述，SIRT1普遍高表達于肝癌組織，且其相對表達水平與肝癌微血管侵犯，腫瘤TNM分期，肝癌的復(fù)發(fā)和綜合生存率具有明顯的相關(guān)性，表明SIRT1的表達水平可作為評估肝癌轉(zhuǎn)移的有效的預(yù)后指標(biāo)。敲除SIRT1明顯降低肝癌細胞的體外侵襲和體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。進一步機制研究發(fā)現(xiàn)敲除SIRT1可明顯降低線粒體發(fā)生的水平和減少ATP的產(chǎn)生，但卻不影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的進程。肝癌組織中SIRT1的過表達與PGC-

17、1α的上調(diào)明顯相關(guān)，而肝癌細胞中外源性過表達SIRT1明顯增加PGC-1α的表達水平，敲除SIRT1的表達可降低PGC-1α的活性。通過細胞株及肝臟原位移植模型實驗證實PGC-1α的過表達可以逆轉(zhuǎn)敲除SIRT1所致的肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的降低，是通過增強線粒體的發(fā)生而介導(dǎo)。通過該研究，闡明了SIRT1促進肝癌轉(zhuǎn)移的新機制，為探索高效的用于SIRT1/PGC-1α軸的靶向治療提供理論依據(jù)，為豐富肝癌的個體化治療和提高預(yù)后具有積極的意義。