β-arrestin1通過(guò)介導(dǎo)HIF1α依賴的PKM2表達(dá)參與胃癌的發(fā)生.pdf

1、目的:
　　研究β-arrestin1在調(diào)節(jié)腫瘤代謝中的分子機(jī)制，以及該機(jī)制在胃癌的發(fā)生發(fā)展中的作用，為防治胃癌的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)，為抑制癌癥發(fā)生的藥物研究提供靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.在組織水平上，從臨床標(biāo)本（癌旁正常組織和胃癌）中，通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)β-arrestin1在細(xì)胞中的定位和表達(dá)情況，在檢測(cè)HIF1α、PKM2在組織標(biāo)本中的表達(dá)水平，初步確定這三個(gè)分子之間的相關(guān)性。
　　2.在分子水平上，

2、應(yīng)用幽門螺桿菌的毒力因子CagA高表達(dá)質(zhì)粒處理細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)定量以及Westernblotting檢測(cè)其對(duì)β-arrestin1在mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響，并檢測(cè)該處理對(duì)HIF1α和PKM2的表達(dá)水平的影響;同時(shí)，通過(guò)免疫熒光和熒光素酶活性檢測(cè)檢測(cè)β-arrestin1與HIF1α以及PKM2之間的相互作用;另外，還通過(guò)β-arrestin1的siRNA以及對(duì)應(yīng)的NCsiRNA干擾掉細(xì)胞內(nèi)β-arrestin1的表達(dá)，檢測(cè)HIF1α

3、和PKM2的表達(dá)水平，從而進(jìn)一步明確這三個(gè)分子之前的相關(guān)性，具體方法如下:
　　1)利用羅氏轉(zhuǎn)染試劑把CagA的高表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞AGS、BGC-823和永生化細(xì)胞GES-1中，48小時(shí)后收細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，再用Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA后用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)β-arrestin1及其HIF-A和PKM2mRNA的表達(dá)水平，蛋白水平的檢測(cè)用Western Blotting方法。

4、
　　2)利用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑把β-arrestin1的siRNA以及對(duì)應(yīng)的NCsiRNA轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞AGS、BGC-823和永生化細(xì)胞GES-1中，72小時(shí)后收細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，再用Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA后用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)β-arrestin1及其HIF-A和PKM2mRNA的表達(dá)水平，蛋白水平的檢測(cè)用WesternBlotting方法。
　　3)CagA的高表達(dá)質(zhì)粒及

5、其對(duì)照質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞AGS和BGC-823中12小時(shí)后，經(jīng)4％多聚甲醛固定細(xì)胞后，進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)(immuno fluorescence test)，檢測(cè)β-arrestin1和HIF1α的細(xì)胞內(nèi)分布情況以及相關(guān)。
　　4)CagA的高表達(dá)質(zhì)粒和帶有HRE位點(diǎn)的報(bào)告基因質(zhì)粒分別被共轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞AGS和BGC-823中48小時(shí)后，通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)檢測(cè)CagA對(duì)HIF1α與PKM2相互結(jié)合的影響;應(yīng)用β-arrestin1

6、的siRNA以及對(duì)應(yīng)的NCsiRNA干擾掉細(xì)胞內(nèi)β-arrestin1的表達(dá)，再將CagA的高表達(dá)質(zhì)粒和帶有HRE位點(diǎn)的報(bào)告基因質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞AGS和BGC-823中48小時(shí)后，通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)檢測(cè)CagA對(duì)HIF1α與PKM2相互結(jié)合的影響。
　　3.在動(dòng)物水平上，通過(guò)摘眼球取已建立的小鼠感染模型的C57小鼠的血，用南京建成生物工程公司生產(chǎn)的葡萄糖測(cè)試盒和乳酸測(cè)試盒分別檢測(cè)小鼠血中葡萄糖以及乳酸的含量，明確在幽門螺

7、桿菌持續(xù)感染的情況下，小鼠體內(nèi)代謝所發(fā)生的明顯改變，從而說(shuō)明幽門螺桿菌的持續(xù)感染對(duì)代謝的影響以及在胃癌的發(fā)生發(fā)展中所起的作用。
　　結(jié)果:
　　1.在組織水平檢測(cè)中，β-arrestin1、HIF1α和PKM2的表達(dá)在胃癌組織標(biāo)本中比癌旁正常組織中的表達(dá)顯著升高。
　　2.胃癌細(xì)胞AGS、BGC-823和永生化細(xì)胞GES-1中轉(zhuǎn)入CagA高表達(dá)質(zhì)粒48小時(shí)后，β-arrestin1的mRNA和蛋白水平的表達(dá)明顯升高，H

8、IF1α和PKM2的表達(dá)也明顯升高。CagA高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞AGS和BGC-823中12小時(shí)后，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)入核的β-arrestin1較對(duì)照組的明顯增加，且HIF1α的分布較對(duì)照組更加規(guī)律，部分出現(xiàn)β-arrestin1和HIF1α共定位的現(xiàn)象。
　　3.胃癌細(xì)胞AGS、BGC-823中轉(zhuǎn)入β-arrestin1siRNA72小時(shí)后，β-arrestin1的mRNA和蛋白水平的表達(dá)幾乎沒(méi)有，HIF1α和PKM2的

9、表達(dá)出現(xiàn)明顯下降。
　　4.在胃癌細(xì)胞AGS和BGC-823中共轉(zhuǎn)染CagA高表達(dá)質(zhì)粒和報(bào)告基因質(zhì)粒48小時(shí)后，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，較之空白對(duì)照組，熒光素酶活性顯著升高;而干擾掉細(xì)胞內(nèi)β-arrestin1的表達(dá)后，再共轉(zhuǎn)染CagA高表達(dá)質(zhì)粒和報(bào)告基因質(zhì)粒48小時(shí)后，熒光素酶活性較之空白對(duì)照組出現(xiàn)明顯下降現(xiàn)象。
　　5.通過(guò)取小鼠血檢測(cè)血清中葡萄糖和乳酸的含量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)幽門螺桿菌持續(xù)感染的小鼠較對(duì)照組小鼠，血清中葡