PGC-1α調(diào)控的線粒體ROS通路在2型糖尿病腎病發(fā)病中的作用.pdf

1、目的：腎小球系膜細(xì)胞的肥大和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積是糖尿病腎病腎小球硬化的重要病理基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的線粒體活性氧（ROS）形成的增加參與了糖尿病腎臟損害的發(fā)生和發(fā)展。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coacfivator-lα,PGC-1α）是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要的核輔激活因子，其廣泛參與線粒體的生物合成代謝，并可調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)（融

2、合和分裂平衡）。研究發(fā)現(xiàn)線粒體的融合和分裂平衡改變控制影響 ROS的生成。PGC-1α是否通過調(diào)節(jié)線粒體融合與分裂平衡影響ROS的生成，繼而進(jìn)一步導(dǎo)致糖尿病狀態(tài)下系膜細(xì)胞功能的異常，目前尚未見有報(bào)道。本研究擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)探討PGC-1α在高糖情況下調(diào)控系膜細(xì)胞ROS、線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞肥大中的作用及其可能的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　⑴正常對(duì)照組大鼠（10只），DM組大鼠（5只），檢測(cè)血糖

3、、膽固醇、甘油三酯、尿白蛋白、肌酐等指標(biāo)，并進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察；
　　(2)細(xì)胞免疫熒光染色觀察DNA損傷產(chǎn)物8-OHdG在腎小球中的變化。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　(1)系膜細(xì)胞同步化后分成：正常糖濃度組（5.6mmol/L葡萄糖），高糖濃度組（30 mmol/L葡萄糖），繼續(xù)觀察培養(yǎng)48h后，應(yīng)用雙氯熒光素(DCFH-DA)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)ROS，觀察高葡萄糖濃度對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞活性氧（ROS）的影響。血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，B

4、CA法蛋白定量，計(jì)算兩組的總蛋白和細(xì)胞數(shù)之比。
　　(2)系膜細(xì)胞同步化后分成：正常糖濃度組（5.6mmol/L），甘露醇組（5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L甘露醇），高糖濃度組（30 mmol/L），繼續(xù)觀察培養(yǎng)48h后，應(yīng)用MitoTracker? Red CMXRos線粒體特異性染料標(biāo)記線粒體，觀察高糖狀態(tài)下大鼠腎小球系膜細(xì)胞線粒體形態(tài)的變化規(guī)律。Western blot檢測(cè)PGC-1α蛋白表達(dá)改變，線粒體分裂

5、蛋白DRP1表達(dá)水平。
　　(3)應(yīng)用基因沉默技術(shù)，沉默系膜細(xì)胞PGC-1α的表達(dá)后，檢測(cè)各組ROS水平，評(píng)估線粒體形態(tài)變化，細(xì)胞肥大的改變；WB檢測(cè)線粒體分裂蛋白DRP1的表達(dá)變化。(4)應(yīng)用基因過表達(dá)技術(shù)，系膜細(xì)胞過表達(dá)PGC-1α后，檢測(cè)各組ROS水平，評(píng)估線粒體形態(tài)變化，細(xì)胞肥大。
　　結(jié)果：
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　⑴SD大鼠一般資料顯示，糖尿病組的血糖、24h尿白蛋白均較對(duì)照組顯著增加（P＜0.001），腎

6、臟肥大指數(shù)（腎重/體重）也明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。
　　⑵24h尿白蛋白測(cè)定顯示，DM組的尿白蛋白在成模后4、8、12周均較對(duì)照組顯著增加。
　　⑶ HE染色結(jié)果顯示，2型糖尿病腎病大鼠腎小球體積明顯增大，系膜基質(zhì)增生。免疫組化顯示，糖尿病組的腎小球纖維連接蛋白（FN）明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。
　　⑷免疫熒光顯示糖尿病組腎小球中8-OHdG較正常對(duì)照組顯著升高

7、。⑸糖尿病大鼠腎臟組織的PGC-1α蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低（P＜0.001）。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　基礎(chǔ)狀態(tài)高糖與低糖條件下細(xì)胞ROS、線粒體形態(tài)、細(xì)胞大小、PGC-1蛋白水平的差異
　　(1)系膜細(xì)胞在30mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48h后，可見細(xì)胞內(nèi)ROS水平較5.6mmol/L對(duì)照組顯著增加（P＜0.001）；
　　(2)高濃度葡萄糖培養(yǎng)基（30mmol/L）孵育系膜細(xì)胞48h后，細(xì)胞線粒體變短變小，線粒體

8、斷裂增加，與正常對(duì)照組具有明顯差異。線粒體的FF和AR的平均值較正常糖濃度組顯著降低（P＜0.01）；
　　(3)高糖培養(yǎng)可使系膜細(xì)胞線粒體分裂蛋白 DRP1表達(dá)增加，顯著高于對(duì)照組和甘露醇組（P＜0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　(4)高糖孵育48h的系膜細(xì)胞的總蛋白/細(xì)胞數(shù)之比顯著大于低糖對(duì)照組（P＜0.05）；
　　(5)30mmol/L葡萄糖濃度孵育的系膜細(xì)胞的 PGC-1α蛋白表達(dá)水平也較正常對(duì)照組顯著降

9、低（P＜0.001），提示PGC-1α可能參與了DN的發(fā)生。
　　PGC-1基因沉默
　　(1) PGC-1α沉默后，發(fā)現(xiàn)PGC-αshRNA組的ROS水平較對(duì)照組（5.6mmol/L糖濃度培養(yǎng)基）顯著增加（P＜0.001），與高糖作用類似；
　　(2) PGC-1α基因沉默后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，PGC-1α-shRNA組細(xì)胞內(nèi)的大部分線粒體變短變小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，線粒體斷裂增加，與高糖作用類似；
　　(3)

10、 PGC-1α基因沉默后，發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞DRP1蛋白較正常對(duì)照組顯著增加（P＜0.001），與高糖效果一致；
　　(4) PGC-1α基因沉默后，發(fā)現(xiàn)PGC-1α-shRNA組細(xì)胞的總蛋白與細(xì)胞數(shù)之比顯著高于正常對(duì)照組和shRNA陰性組（P＜0.05）；
　　PGC-1α基因過表達(dá)
　　(1)基因過表達(dá)PGC-1α后，轉(zhuǎn)染組高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞的ROS強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），而空載體組較對(duì)照組無顯著差異（P＞0

11、.05）。
　　(2)基因過表達(dá) PGC-1α后，高糖培養(yǎng)液孵育48h，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)線粒體呈管狀，長(zhǎng)條形，具有正常的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與5.6mmol/L糖濃度的正常條件下的細(xì)胞線粒體形態(tài)一致；
　　(3) PGC-1α基因過表達(dá)組的總蛋白與細(xì)胞數(shù)之比顯著低于高糖對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染組（P＜0.01），而空載體轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比無顯著差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1）糖尿病鼠腎組織病理損傷、ROS生