Rho-Rho激酶通路與轉化生長因子β1通路在2型糖尿病大鼠腎病中的作用.pdf

1、目的：糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，目前臨床上還沒有特別有效的措施能夠阻止DN的發(fā)生和進展。本研究通過探討Rho/Rho激酶(ROCK)信號通路與轉化生長因子β1(TGF-β1)信號通路在2型糖尿病大鼠腎病發(fā)病機制中的作用以及ROCK特異性抑制劑法舒地爾(fasudil)對DN的干預效應，有可能為DN提供新的防治策略。
　　方法：通過高脂飲食結合一次性腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ，30mg/kg，i

2、.p.)建立2型糖尿病大鼠模型，并設立正常對照組。10w末，行高胰島素正常葡萄糖鉗夾試驗，測定葡萄糖輸注率(GIR)，證實糖尿病動物模型胰島素抵抗的存在；經(jīng)腹主靜脈取血檢測空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)。隨后將糖尿病大鼠隨機分為糖尿病組和法舒地爾干預組(10mg/kg/day，i.p.)。每周測各組大鼠體重及鼠尾收縮壓(SABP)。24w末留24h尿，測尿白蛋白排泄率(UAER)；腹主靜脈取

3、血測FBG、FINS、TG、TC、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和糖化血紅蛋白(HbA1c)。稱取左側腎臟重量，計算腎臟質量(KW)與體質量(BW)的比值(KW/BW)。分別留取腎組織供HE染色觀察腎臟組織形態(tài)；Masson染色和羥脯氨酸(HYP)含量測定評估腎組織膠原沉積情況；逆轉錄多聚酶鏈反應法(RT-PCR)測定腎皮質TGF-β1mRNA、結締組織生長因子(CTGF)mRNA表達水平；Western blot法測定腎皮質磷酸化的肌

4、球蛋白磷酸酯酶靶點亞單位1(p-MYPT1)水平，代表ROCK的活性。
　　結果：
　　1一般情況
　　對照組大鼠進食、飲水、活動如常，毛色正常。而糖尿病大鼠則出現(xiàn)明顯的多食、多飲、多尿，活動明顯減少，毛色晦暗。
　　2胰島素抵抗指標10w末，與對照組相比，糖尿病大鼠GIR顯著降低(5.45±0.84mg/kg/min vs11.34±0.76mg/kg/min，P<0.01)。24w末計算三組大鼠的胰島素抵抗指

5、數(shù)(HOMA-IR=FBG×FINS÷22.5)。與對照組相比，糖尿病組和法舒地爾干預組大鼠的HOMA-IR顯著增高(110.86±5.27與109.17±4.88分別vs12.23±1.99，P<0.01)。而糖尿病組和法舒地爾干預組大鼠HOMA-IR的差異無統(tǒng)計學意義(110.86±5.27 vs109.17±4.88，P>0.05)。
　　3 BW、KW和KW/BW10w末，糖尿病大鼠BW明顯高于對照組(P<0.05)。24

6、w末，糖尿病組和法舒地爾干預組大鼠的BW明顯低于對照組(P<0.05)。糖尿病組和法舒地爾干預組大鼠的BW差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組相比，糖尿病組大鼠的KW和KW/BW顯著增高(P<0.01)。法舒地爾干預組大鼠的KW和KW/BW較糖尿病組顯著降低(P<0.01)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　4血生化指標
　　10w末，糖尿病大鼠的FBG、FINS、TG與對照組相比顯著增高(P<0.0

7、1)，TC與對照組相比顯著增高(P<0.05)。24w末，糖尿病組和法舒地爾干預組大鼠與對照組相比，F(xiàn)BG、FINS、TG、TC、HbA1c均顯著增高(P<0.01)。而這些指標在糖尿病組和法舒地爾干預組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　5腎臟相關指標與SABP24w末，與對照組相比，糖尿病組大鼠的UAER顯著增加(0.35±0.04μg/min vs0.05±0.01μg/min，P<0.01)。而法舒地爾干預組

8、大鼠的UAER較糖尿病組顯著減少(0.08±0.04μg/min vs0.35±0.04μg/min，P<0.01)。法舒地爾干預組大鼠的UAER仍高于對照組(0.08±0.04μg/min vs0.05±0.01μg/min，P<0.05)。三組大鼠的血Cr差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。糖尿病組和法舒地爾干預組大鼠的BUN較對照組顯著增高(13.56±2.19mmol/L與13.36±1.81mmol/L分別vs8.01±1.11

9、mmol/L，P<0.01)，而糖尿病組和法舒地爾干預組比較差異無統(tǒng)計學意義(13.56±2.19mmol/L vs13.36±1.81mmol/L，P>0.05)。三組大鼠的SABP差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　6 HE染色結果對照組大鼠腎小球結構正常；腎小管上皮細胞排列整齊，胞漿豐富。與對照組相比，糖尿病組大鼠腎小球肥大，系膜區(qū)明顯擴張，系膜基質增多；腎小管上皮細胞結構紊亂，胞漿丟失，泡沫樣變。法舒地爾干預組上述改變

10、均較糖尿病組明顯減輕。
　　7 HYP含量測定與對照組相比，糖尿病組大鼠腎組織HYP含量顯著增加(0.50±0.05μg/mg vs0.36±0.07μg/mg，P<0.01)。法舒地爾干預組與糖尿病組相比，HYP含量明顯減少(0.37±0.04μg/mg vs0.56±0.05μg/mg，P<0.01)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(0.37±0.04μg/mg vs0.36±0.07μg/mg，P>0.05)。
　　8

11、Masson染色結果對照組大鼠腎間質及血管周圍可以見到少量膠原纖維的分布，膠原面密度為0.076±0.005。與對照組相比，糖尿病組大鼠腎間質及血管周圍的膠原纖維顯著增多(膠原面密度：0.148±0.007 vs0.07±0.005，P<0.01)。法舒地爾干預組大鼠腎間質及血管周圍的膠原纖維較糖尿病組大鼠顯著減少(膠原面密度：0.0794±0.007 vs0.148±0.007，P<0.01)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(膠原面密度

12、：0.0794±0.007 vs0.0764±0.005，P>0.05)。
　　9免疫組化染色結果與對照組相比，糖尿病組大鼠腎組織中TGF-β1蛋白表達顯著增多(陽性面積：21.4±3.1％vs4.3±1.5％，P<0.01)。法舒地爾干預組大鼠腎組織中TGF-β1蛋白表達較糖尿病組大鼠顯著減少(陽性面積：5.14±2.3％vs21.4±3.1％，P<0.01)，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(陽性面積：5.1±2.3％vs4.3

13、4±1.5％，P>0.05)。
　　10基因表達結果與對照組相比，糖尿病組大鼠腎皮質TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA表達均顯著增加(P<0.01)。法舒地爾干預組TGF-β1mRNA、CTGFmRNA表達較糖尿病組大鼠顯著降低(P<0.01)，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　11蛋白表達結果與對照組相比，糖尿病組大鼠腎皮質p-MYPT1水平顯著增加(P<0.01)。法舒地爾干預組大鼠腎皮質p-

14、MYPT1較糖尿病組顯著減少(P<0.01)，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結論：高血糖能夠激活腎臟Rho/ROCK信號通路，該通路參與了對TGF-β1和CTGF表達的調控，在糖尿病腎臟系膜細胞外基質增多的形成中發(fā)揮著重要作用。Fasudil能夠有效地抑制糖尿病腎纖維化，減少尿蛋白，這可能與它抑制了腎臟上TGF-β1/CTGF信號通路有關，發(fā)揮著不依賴于血壓、血糖控制的腎臟保護作用。本研究結果提示抑制ROC