腎康丸處方優(yōu)化研究及其對糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子β2型受體表達(dá)的影響.pdf

1、糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)全身微血管病變的腎臟表現(xiàn)，為DM常見的慢性并發(fā)癥之一。目前，DM已成為繼腫瘤、心腦血管病之后第3位嚴(yán)重危害人類健康的慢性病，全球約有1.35億名DM患者，我國估算為3000～4000萬人，且發(fā)病率有不斷增高趨勢。DN一旦出現(xiàn)大量蛋白尿，提示預(yù)后不良，常進(jìn)展至終末期腎衰，給個人和社會造成巨大負(fù)擔(dān)，因此出現(xiàn)微量白蛋白尿(MAU)的早期DN進(jìn)行積極治療顯尤為重要，可以明顯減少臨床期DN的發(fā)病率或者延緩臨床期D

2、N的發(fā)生。本實驗分兩部分研究了治療DN的經(jīng)驗方劑腎康丸，第一部分應(yīng)用正交試驗方法探討腎康丸的組方可能的最佳劑量配比，及方中對微量白蛋白排泄率(UAE)起顯著治療作用的方藥，并與原方進(jìn)行比較，觀察2方對DN大鼠的腎保護(hù)效果；第二部分應(yīng)用免疫組化(SABC法)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測腎康丸治療后DN大鼠腎皮質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子β2型受體(TβRⅡ)抗原及其mRNA表達(dá)的情況，觀察腎康丸對DN大鼠腎皮質(zhì)TβRⅡ表達(dá)的影響。

3、 第一章腎康丸處方正交設(shè)計法優(yōu)化研究 目的：探討治療DN經(jīng)驗方腎康丸改善UAE有效藥味及最佳劑量配比。 方法：選用L27(313)正交表，以腎康丸中黃芪(A)、B、水蛭(C)、D、E、玉米須(F)6味中藥為6個因素，考察A與B、A與C、A與F的交互效應(yīng)，按經(jīng)驗選取每味中藥的3個劑量水平，對劑量水平隨機排序，按正交表組成27個處方，每個處方以水提法制成3g/m1懸濁液，按1.08ml/220gwt分別灌胃，75只SD大鼠采

4、用單側(cè)腎切除后腹腔注射鏈脲佐菌素制作DN大鼠模型，DN成模時有59只大鼠，隨機分成27組，每組隨機選取1只大鼠作考察對象，每組中的另外1-2只大鼠作備用大鼠接受考察大鼠相同處理，當(dāng)考察大鼠在實驗結(jié)束前死亡時在備用大鼠中隨機選取1只大鼠繼續(xù)觀察，并取用備用鼠治療前的UAE值。以治療前UAE為協(xié)變量，以治療8周后UAE作為考察指標(biāo)進(jìn)行正交設(shè)計的協(xié)方差分析及基于協(xié)方差分析的多重比較，得出腎康丸中對治療后UAE有顯著治療效果的中藥及可能的最佳配

5、比。 結(jié)果： 1、腎康丸6味藥中A、C、F對DN大鼠治療末UAE有顯著治療效果(P＜0.040)，而B、D、E對UAE的影響不顯著(P＞0.056)，A與B、A與C、A與F之間交互效應(yīng)不顯著(P＞0.175)。 2、腎康丸方中對DN大鼠UAE影響大小順序：A＞F＞C，優(yōu)化方中A、B、C、F均取中劑量水平，D、E均取最小劑量水平為佳。 3、腎康丸原方與優(yōu)化方的腎保護(hù)作用無顯著差異。 4、腎康丸給藥前

6、后UAE的變化：給藥前造模各組之間UAE水平比較無顯著性差異(P=0.607)，與正常組比較均顯著升高(P＜0.05)。給藥前后比較DNS組、DNY組、DNK組UAE值顯著下降(t值分別為-5.188、-3.522、-3.766；P＜0.013)，但均較NC組高(P＜0.05)；DN組實驗結(jié)束時UAE值顯著升高(t=3.072，P=0.028)，與DNS、DNY、DNK組治療后比較均有顯著性意義(P＜0.05)。治療后DNS、DNY、D

7、NK三組間UAE值比較無顯著差異(P＞0.337)。 5、各組大鼠體重、腎重、相對腎重、血生化情況：治療后DNS、DNY組體重(bwt)、腎重/體重(k/bwt)、尿素(Urea)、總膽固醇(TC)及三酰甘油(TG)均較DN組有顯著改善作用(P＜0.05)，但仍較NC組差(P＜0.05)。DNS與DNY組比較，體重(bwt)、腎重(kwt)、腎重/體重(k/bwt)、血肌酐(Scr)、尿素(Urea)、總膽固醇(TC)及三酰甘油

8、(TG)比較均無顯著差異(P＞0.069)，與DNK比較，DNS、DNY的相對腎重、肌酐、尿素均無顯著差異(P＞0.093)，但體重顯著高于DNK組(P＜0.05)，總膽固醇及三酰甘油顯著低于DNK組(P＜0.05)。血糖秩次比較，DNS與DNY比較接近，均明顯低于DNK及DN組，但仍明顯高于NC組。 6、與NC組大鼠腎組織病理切片比較，DN組可見腎小球體積增大，大量系膜增生，近曲小管細(xì)胞肥大、空泡樣變性；DNS、DNY、DNK

9、組腎小球系模增生減輕，腎小球體積增大明顯減輕。 結(jié)論： 1、腎康丸處方A、F、C三味中藥都對UAE具有顯著的治療作用，B、D、E三味中藥可能起輔助作用，A與B、A與C、A與F之間的交互效應(yīng)不顯著，處方優(yōu)化的結(jié)果，腎康丸原方為最優(yōu)化處方。 2、中藥腎康丸與西藥開博通比較，除有相似的腎保護(hù)作用外，更能發(fā)揮多靶點的腎保護(hù)作用，顯示出中藥在DN的腎保護(hù)作用方面有一定的優(yōu)勢。 第二章腎康丸對DN大鼠腎皮質(zhì)TβRⅡ的

10、影響 目的：觀察DN大鼠TβRⅡ抗原及其mRNA表達(dá)的變化，探討腎康丸治療DN大鼠的可能機制。 方法： 1、動物標(biāo)本采集：實驗?zāi)┟拷M大鼠簡單隨機法取4只，解剖大鼠后，摘取腎臟，稱重，去除包膜，經(jīng)4℃預(yù)冷DEPC水反復(fù)沖洗腎臟，修剪腎皮質(zhì)，取約0.1g于EP管，立即保存于-80℃冰箱中待測。 2、免疫組織化學(xué)染色：組織切片脫蠟至水后，經(jīng)PBS沖洗，滴加10％正常山羊血清2滴，蓋滿組織片，室溫30分鐘，傾去勿

11、洗，取一抗工作液(兔抗TβRⅡ(1∶100))75μl覆蓋組織片，置潔凈塑料盒蓋上蓋防蒸發(fā)，4℃過夜(16小時左右)，同時以PBS設(shè)置一抗陰性對照。 3、TβRⅡ抗原表達(dá)計分：每組隨機選取4個切片標(biāo)本，每張切片在高倍鏡下隨機選擇10個腎小球和10個視野腎小管間質(zhì)，根據(jù)染色面積和強度按法進(jìn)行半定量評分，TβRⅡ陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，以出現(xiàn)清晰的淺黃色—棕褐色顆粒判定為陽性，細(xì)胞核不表達(dá)。反應(yīng)結(jié)果根據(jù)胞質(zhì)、胞膜的著色程度計

12、分：胞質(zhì)、胞膜無著色，計0分；淡黃色為或染色面積＜25％，計1分；棕黃色或染色面積在25％～50％之間，計2分；棕褐色或染色面積＞50％，計3分。 4、RT-PCR檢測TβRⅡ基因的表達(dá)：實驗采用RT-PCR法，檢測腎康丸對TβRⅡmRNA表達(dá)水平的影響。每組隨機選取4份腎組織標(biāo)本，Trizol法提取腎組織總RNA，以0.1％DEPC處理水50μl溶解后分裝，加RNAin保存于-80℃冰箱。TβRⅡ、GAPDH引物序列，TβRⅡ

13、：引物1序列為：5'GCAGAACACTTCAGAGCAGTTTG3'；引物2序列為：5'CAGGTCATCCACAGACAGAGTAGG3'；GAPDH：引物1序列為：5'AGATCCACAACGGATACATT3'；引物2序列為：5'TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3'。取總RNA5μl加至一步法RT-PCR試劑盒20μl反應(yīng)體系，再加0.3μl下游引物，70℃5分鐘后置冰上加上游引物0.3μl，補加DEPC處理水至20μl

14、，42℃，60分鐘形成cDNA，94℃，5分鐘，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94℃1分鐘，55℃1分30秒，72℃2分鐘，72℃延伸7分鐘，30個循環(huán)，TβRⅡ擴(kuò)增產(chǎn)物長度為348bp，GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物長度為309bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl，加上樣緩沖液lμl，在2.0％瓊脂糖凝膠中電泳，緩沖液為0.5×TBE電泳緩沖液，恒定電壓90v，80分鐘。于紫外燈下拍照，將膠片上反應(yīng)帶在GelDoc1000凝膠成像分析系統(tǒng)中

15、掃描、分析電泳帶的灰度，目的基因mRNA表達(dá)量=每例標(biāo)本目的基因凝膠圖像平均灰度值/同一標(biāo)本GAPDH凝膠圖像平均灰度值。 結(jié)果： 1、大鼠腎組織TβRⅡ免疫組化：TβRⅡ抗原著色在DN、DNS、DNY、DNK組腎小球及腎小管均有不同程度表達(dá)，在NC組及一抗陰性切片上無或弱表達(dá)。就陽性著色部位言，腎小管及間質(zhì)TβRⅡ抗原表達(dá)較顯著，腎小球呈弱表達(dá)，腎小球與間質(zhì)小管間比較差異顯著(Z=-6.165，P＜0.001)。腎小球

16、5組間比較差異顯著(χ2=15.163，P=0.004)，腎小管間質(zhì)五組間比較也有顯著性差異(χ2=39.252，P＜0.001)，DNS、DNY、DNK組著色計分平均秩次明顯低于DN組，但仍明顯高于NC組，DNS、DNY、DNK三組著色計分秩次相當(dāng)。 2、大鼠腎組織TβRⅡmRNA的表達(dá)：各組大鼠RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，Marker標(biāo)記片斷為348bp和309bp，符合目的基因長度。各組間相對量比較具有顯著性差異(F

17、=94.674，P＜0.001)。TβRⅡmRNA表達(dá)DNS、DNY、DNK三組較DN組均有顯著下降(P＜0.05)，DNS、DNY、DNK三組間比較無顯著差異(P=0.402)，但仍顯著高于NC組(P＜0.05)。 結(jié)論： 1、DN大鼠腎皮質(zhì)TβRⅡ抗原表達(dá)主要定位于腎小管，腎小球表達(dá)量較少。 2、腎康丸具有顯著的腎保護(hù)作用，有與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑開博通相似的下調(diào)DN大鼠腎皮質(zhì)TβRⅡ抗原及mRNA表達(dá)的效