腎康丸對糖尿病腎病大鼠腎臟保護作用及對CD2AP、ZO-1表達的影響.pdf

1、眾所周知,糖尿病(Diabetic mellitus,DM)已成為21世紀世界范圍內(nèi)的一種流行病。它是繼腫瘤、血管病變之后第三大嚴重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病,具有高致死率、高致殘率和高醫(yī)療花費的特征,成為當前世界各國共同面對的公共健康問題。DM在中國的嚴峻形勢更是發(fā)人深省。在最新一期國際著名醫(yī)學(xué)期刊《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上,一篇名為“中國人群中的DM患病率”的研究論文公布了最近調(diào)查結(jié)果:中國DM患者人數(shù)達9200萬,數(shù)量達到世界第一

2、。其增長速度令人震驚。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是DM患者最常見、最嚴重的全身性微血管并發(fā)癥之一。在歐美國家DN占終末期腎臟病(end stage renar disease,ESRD)透析病人第一位的病因,而在我國,DN雖不是ESRD的首要病因,但每年以高速率遞增。DN是腎臟疾病中治療最為困難、發(fā)展速度快、預(yù)后差,進展成ESRD醫(yī)療費用高的嚴重危害人民健康的繼發(fā)性腎小球疾病。因此,明確DN的發(fā)病機制及

3、治療方法成為了當前臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中首當其沖要解決的問題。
　　 既往研究認為,DN的主要病理特征是細胞外基質(zhì)的堆積、系膜增寬、基底膜增厚,腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。然而這些因素僅能解釋30％-50％的尿蛋白排泄率和腎小球濾過率的變化。DN的發(fā)病機制仍未完全明確。近年來,隨著對腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)和功能改變的研究,尤其是對腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)成分的足細胞在DN的發(fā)生發(fā)展中的作用,成為研究熱點。目前已經(jīng)證實足細胞的異常改變是DN的主要病理

4、學(xué)改變,并和其相關(guān)蛋白的改變一起在DN的發(fā)病中起到關(guān)鍵性作用。足突細胞裂孔隔膜(slitdiaphragm,SD)是腎小球濾過屏障的重要組成成分,起到“靜態(tài)分子篩”的作用,同時它又是高度“動態(tài)”的功能復(fù)合體,參與了對維系足細胞正常生物學(xué)所必須的信號傳導(dǎo)的發(fā)生與傳遞和細胞骨架的組成。CD2AP(CD2-associated protein)是構(gòu)成其信號傳導(dǎo)的主要分子,主要與podocin和nephrin以蛋白復(fù)合體的形式存在。CD2AP基

5、因敲除的小鼠可發(fā)生先天性腎綜。研究發(fā)現(xiàn),其還可能與actin相互結(jié)合,將nephrin錨定在actin細胞骨架上的作用。ZO-1(zonula occudens-1)是細胞骨架接頭蛋白之一,能將SD相關(guān)蛋白連接到細胞骨架上,對維持足突細胞的完整性有重要的作用。近期研究發(fā)現(xiàn),它又能與SD組成蛋白之一的NEPH1(足細胞的一種組成蛋白)相結(jié)合,誘導(dǎo)其信號傳導(dǎo)。而CD2AP在蛋白復(fù)合體中是否通過作為NEPH1的同源分子nephrin(足細胞的

6、一種主要的組成蛋白)與ZO-1有聯(lián)系作用,且在DN病變過程中,ZO-1表達的變化以及它與足細胞數(shù)目減少的關(guān)系至今還未完全闡明。
　　 目前西醫(yī)治療DN主要是控制高血糖、減少蛋白尿、控制高血壓、低蛋白飲食及糾正脂代謝紊亂等對癥治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)類藥物及血管緊張素Ⅱ(AngioteninⅡ,AngⅡ)受體拮抗劑能減少蛋

7、白尿,具有一定程度保護DN腎臟的作用,但它們也不能完全阻斷DN進展。而中醫(yī)方面在延緩DN病情的進展和腎衰竭方面顯示出良好的效果,但DN臨床分型無統(tǒng)一標準和量化指標,涉及方藥很多,且有一些自擬方,藥物加減變化較大,療效標準不統(tǒng)一,限制了其推廣應(yīng)用。目前DN缺乏有效的藥物治療,至今尚沒有一個能完全阻止DN進展的藥物。中醫(yī)藥從CD2AP和ZO-1方面的研究未見報道。因此,積極探求DN的治療與CD2AP、ZO-1的關(guān)系具有重要意義。
　　

8、 第一章腎康丸對DN大鼠腎臟的保護作用以及對腎組織CD2AP、ZO-1的影響
　　 [目的]探討腎康丸對 DN大鼠模型的腎臟保護作用以及對CD2AP和ZO-1表達的影響,為進一步研究藥物作用機制提供實驗依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1.DN大鼠模型的制備:首先用鏈脲佐菌素(STZ)以55 mg·kg-1大鼠體重左下腹腔內(nèi)一次性注射制作DM大鼠模型。連續(xù)喂養(yǎng)2w,測血糖、尿量,若血糖值>16.6mmol·L—1、

9、尿量>原尿量150％、尿蛋白排泄>30mg·kg·/24h-1以上,則造模成功。
　　 2.分組和給藥:大鼠造模成功后,稱重,隨機分為4組:模型對照組,美卡素組和腎康丸組,另設(shè)正常對照組。腎康丸組大鼠實驗用量設(shè)定為1.1g·kg-1大鼠體重,腎康丸研磨后用蒸餾水配成0.22g·mL-1混懸液。美卡素片組大鼠實驗用量設(shè)定為7.2mg·kg-1大鼠體重,美卡素片研磨后用蒸餾水配成2.9mg·mL-1溶液。模型對照和正常對照組大鼠灌服

10、等容積生理鹽水。分別灌服相應(yīng)藥物濃度的混懸液,每日1次,連續(xù)8 w。各組大鼠自由進食飲水,實驗中不予任何降血糖藥物。
　　 3.療效觀察與檢測:
　　 ①一般情況的影響:活動、精神狀態(tài)、毛發(fā)、攝食量、飲水量、大小便、體重。
　　 ②對大鼠腎重、相對腎重的影響。
　　 ③對大鼠血脂(生化法)、尿肌酐(苦味酸法)、血糖(血糖儀)、糖化血紅蛋白(紫外分光光度法)、24 h尿蛋白總量(考馬斯亮蘭法)的影響。

11、>　　 ④對大鼠腎組織病理的影響(光鏡、透射電鏡觀察)。
　　 4.免疫組化法研究CD2AP和ZO-1在正常大鼠和DN大鼠腎臟組織的分布和表達情況。
　　 [結(jié)果]
　　 1.46只大鼠用于造模,成模率78.9％(30/38),成模后病死率4.67％(2/30)。
　　 2.8周治療期間,模型組大鼠血糖均維持在16.7mmol·L-1以上,尿糖卅以上,表現(xiàn)出多飲、多食、多尿、消瘦的DM癥狀,腎康丸、美卡

12、素治療組大鼠一般情況均較模型對照有所改善。
　　 3.正常對照組及各治療組大鼠體重均較治療前增加(P<0.05或P<0.01)；與模型對照組相比較,腎康丸組與美卡素組增長量顯著增加(P<0.01,P<0.05)。
　　 4.與正常對照組比較,各組大鼠血糖、GHb、24hUpro、Scr、BUN、TC、TG、LDL-c均升高(P<0.01),24h尿量及飲水量增加(P<0.01)；與模型對照組比較,腎康丸、美卡素治療均可以

13、降低24hUpro、Scr、BUN及24h尿量及飲水量(P<0.01或P<0.05)；腎康丸治療可以降低血糖、GHb(P<0.05)。各組中,僅腎康丸組TC、TG、LDL-c顯著下降(P<0.01)。
　　 5.與正常對照組比較,各組大鼠HDL-c顯著降低(P<0.01)；與模型對照組相比,腎康丸治療組對HDL-c具有顯著升高作用(P<0.01)。
　　 6.與正常對照組比較,模型組大鼠腎重及相對腎重增加(P<0.01)

14、,且出現(xiàn)了相當于Mogensen分期的3期左右DN病理損害。腎康丸、美卡素病理改變較模型組均有不同程度的減輕,其中腎康丸組效果更為顯著。
　　 7.免疫組化法觀察正常大鼠腎組織中CD2AP主要表達于腎小球足細胞內(nèi),在腎小管,集合管也有少量表達。而ZO-1主要沿著腎小球毛細血管袢呈點狀分布。與正常組相比,模型對照組中CD2AP及ZO-1表達明顯下降,而治療組其表達逐步恢復(fù)正常。其中,腎康丸組CD2AP及ZO-1表達量與正常組無明顯

15、差別。
　　 [結(jié)論]
　　 1.腎康丸能夠改善實驗性DN大鼠一般狀態(tài),具有一定的調(diào)節(jié)血糖、血脂代謝的作用。
　　 2.腎康丸能夠降低實驗性DN大鼠尿蛋白,降低血清BUN及Scr水平,具有一定的保護腎功能作用。
　　 3.腎康丸能夠改善DN大鼠腎臟組織病理學(xué)改變,緩解腎臟病理損傷。
　　 4.腎康丸能上調(diào)CD2AP及ZO-1在DN腎臟組織中的含量,且抑制其易位。
　　 第二章腎康丸對高糖刺

16、激的大鼠腎小球足細胞CD2APmRNA表達的影響
　　 [目的]探討腎康丸對高糖刺激下的大鼠腎小球足細胞(podocyte,PC)CD2APmRNA表達的影響。
　　 [方法]
　　 1.含藥血清的制備:雄性SPF級SD大鼠25只,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機分為5組,分別灌服相應(yīng)藥物濃度的腎康丸(高、中、低劑量)和美卡素混懸液及等容積生理鹽水制作腎康丸高、中、低劑量含藥血清,美卡素含藥血清和正常血清。
　　 2

17、.PC培養(yǎng)分組、干預(yù)及活力測試:由廣東省人民醫(yī)院惠贈,取生長狀態(tài)好的已分化的足細胞隨機分為7組:正常糖組、高糖刺激組、高糖刺激加正常血清組、腎康丸高、中、低劑量組,美卡素組,每組5孔,以相應(yīng)的試劑及藥物血清干預(yù)24小時和48h后,進行細胞活力檢測。
　　 3.根據(jù)活力檢測的結(jié)果選擇效價最高的腎康丸含藥血清組進行PC細胞的培養(yǎng),再次選取一批生長狀態(tài)好的己分化的PC細胞,并將其分為5組:正常糖組、高糖刺激組、高糖刺激加正常血清組、腎

18、康丸組和美卡素組,每組設(shè)6孔。研究其對DN大鼠腎小球足細胞CD2APmRNA表達的影響。
　　 4.RT-PCR法檢測足細胞中CD2APmRNA表達:Trizol法提取和純化PC總RNA,以0.1％DEPC處理水50μl溶解后分裝,加RNAin保存于-70℃冰箱。設(shè)計CD2AP及內(nèi)參GAPDH引物序列,取總RNA2μl進行逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)依照Promega公司提供的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒說明書進行。內(nèi)參照采用GAPDH,檢測PC中C

19、D2APmRNA的表達。
　　 5.用Western blm法檢測足細胞CD2AP的含量。
　　 [結(jié)果]
　　 1.48h內(nèi),腎康丸中劑量較其他劑量對高糖刺激下的足細胞損害的緩解效力最好。
　　 2.與正常組比較,模型組大鼠腎臟CD2AP mRNA表達量減少(P<0.05)；與模型組比較,腎康丸組、美卡素組均可上調(diào)CD2APmRNA的表達,但以腎康丸組上調(diào)顯著(P<0.01),且與正常組相比,無統(tǒng)計學(xué)意

20、義(P>0.05)。
　　 3.用Western blot法觀察到高糖組和正常血清組中CD2AP蛋白表達明顯低于正常糖組,而腎康丸組和美卡素組則稍略低于正常糖組,但與高糖和正常血清組相比則明顯增多。
　　 [結(jié)論]腎康丸可以上調(diào)高糖刺激下的PC中CD2APmRNA及蛋白表達。
　　 第三章腎康丸對高糖刺激的大鼠腎小球足細胞ZO-1mRNA表達的影響
　　 [目的]探討腎康丸對高糖刺激下的PC中ZO—1mR

21、NA表達的影響。
　　 [方法]
　　 同上。
　　 [結(jié)果]
　　 1.與正常組比較,模型組大鼠腎臟ZO—1mRNA表達量減少(P<0.05)；與模型組比較,腎康丸組、美卡素組均可上調(diào)ZO-1mRNA的表達,但以腎康丸組上調(diào)顯著,與高糖組及正常血清組相比有顯著性差異(P<0.01),且與正常組相比,無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2.用Western blot法觀察到高糖組和正常血清組中Z

22、O-1mRNA蛋白表達明顯低于正常糖組,而腎康丸組和美卡素組則稍略低于正常糖組,但與高糖和正常血清組相比則明顯增多。
　　 [結(jié)論]腎康丸可以上調(diào)高糖刺激下的PC中ZO-1mRNA及蛋白表達。全文結(jié)論:本研究通過DN動物模型實驗研究,再次證明腎康丸具有治療DN和保護腎臟的作用；通過觀察腎康丸對DN大鼠及體外高糖培養(yǎng)的PC細胞中CD2AP和ZO-1mRNA的表達情況,提示其可上調(diào)CD2AP和ZO-1的表達,從而能維持腎小球足細胞結(jié)