二黃糖腎康對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及Fas和Fas-L表達(dá)的影響.pdf

1、目的：探討二黃糖腎康對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟保護(hù)機(jī)制。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一。有資料表明西方國(guó)家2型糖尿病患者DN的發(fā)生率為30％～50％，在我國(guó)約有21.5％。目前DN已躍升為終末期腎病的首位原因，占35％左右。迄今為止，單純的中藥或貝那普利尚不能有效地阻止DN對(duì)腎功能損害的自然進(jìn)程。因此，進(jìn)一步探討DN的發(fā)病機(jī)制，尋求新的防治途徑，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

2、DN的主要病理學(xué)特征為。腎臟肥大，腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)和腎小管基底膜(tubular basement membrane，TBM)增厚，腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)進(jìn)行性積聚，導(dǎo)致結(jié)節(jié)性或彌漫性腎小球硬化。這種變化的組織學(xué)基礎(chǔ)即是ECM的積聚。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，細(xì)胞凋亡(apoptosis，APO)的研究不斷深入，證明細(xì)胞凋

3、亡參與了DN的發(fā)生機(jī)制，并導(dǎo)致腎功能進(jìn)一步惡化。研究發(fā)現(xiàn)，腎臟細(xì)胞中存在Fas/Fas-L系統(tǒng)，并參與了糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的調(diào)控。 我院腎病教研室采用益氣扶正、活血通絡(luò)、解毒降濁的治療原則，研創(chuàng)了二黃糖腎康(黃芪、大黃、茯苓、黨參、水蛭、鬼箭羽、懷牛膝、桑寄生等)治療本病，取得了較好的療效。為深入探討二黃糖腎康對(duì)糖尿病腎病腎臟保護(hù)作用的機(jī)制，我們復(fù)制糖尿病腎病模型大鼠，通過(guò)觀察二黃糖腎康對(duì)糖尿病腎病模型大鼠的腎功能、細(xì)胞凋亡

4、及相關(guān)蛋白Fas/Fas-L表達(dá)等的影響，為臨床治療DN提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：選清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體重150-170g。按Anderson等建立的方法隨機(jī)抽取10只大鼠暴露腎臟后縫合，為假手術(shù)組(SO)。其余50只大鼠行右腎切除術(shù)，2周切口完全愈合后，按50mg/kg腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ，Sigma，溶于0.1mol/L，的枸椽酸鈉緩沖液中，pH值4.0)。3．天后尾尖取血，測(cè)定血糖、尿糖和尿蛋白。血糖≥16.

5、7mol/L，尿糖陽(yáng)性，尿蛋白(urinary protein，Upro)陽(yáng)性，尿量大于正常組150％者確定為模型。選40只成模大鼠，按空腹血糖高低層次隨機(jī)為模型組(M)、貝那普利治療組(B)、二黃糖腎康低劑量組(L)、二黃糖腎康高劑量組(H)四組，每組10只。上午B組、L組、H組均給予等量糖適平5mg/kg/d(相當(dāng)于成人劑量的10倍)灌胃；下午B組給予貝那普利1.7mg/kg/d(相當(dāng)于成人劑量的10倍)灌胃，L組給二黃糖腎康提取液

6、18g/kg/d(相當(dāng)于成人劑量的10倍)灌胃，H組給二黃糖腎康提取液36g/kg/d(相當(dāng)于成人劑量的20倍)，SO組和M組用等量蒸餾水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物，本實(shí)驗(yàn)共8周。第8周用代謝籠收集24小時(shí)尿，用于尿蛋白(urinary protein，Upro)測(cè)定；最后一次給藥后，禁食8小時(shí)，稱重，斷頭取血，分離血清用全自動(dòng)生化儀測(cè)定測(cè)空腹血糖(glucose，Glu)、尿素氮(blood urea

7、 nitrogen，BUN)、血肌酐(serumcreatinine，Scr)，用胰島素放射免疫分析藥盒測(cè)定胰島素(insulinum，INS)；無(wú)菌操作取左腎，固定腎組織，用TUNEL法定量觀察凋亡細(xì)胞；用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定腎組織細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期及Fas/Fas-L蛋白表達(dá)量。 結(jié)果：(1)Glu、INS檢測(cè)：模型組比假手術(shù)組明顯升高(19<0.01)；經(jīng)藥物干預(yù)后，治療組均比模型組明顯降低(p<0.01)：Glu，二黃糖腎康

8、高、低劑量組與貝那普利組相比，均明顯降低(p<0.05或p<0.01)，二黃糖腎康高、低劑量組組間有顯著差異(p<0.05)；INS，二黃糖腎康高、低劑量組與貝那普利組相比，二黃糖腎康低劑量有降低趨勢(shì)(p>0.05)，二黃糖腎康高劑量組明顯降低(p<0.05)，二黃糖腎康高、低劑量組間無(wú)顯著差異(p>0.05)。(2)BUN、Scr、Upro檢測(cè)：模型組比假手術(shù)組均明顯升高(p<0.01)；治療組與模型組相比，均明顯降低(P<0.01)

9、；二黃糖腎康高劑量組與貝那普利組相比，有顯著差異(P<0.01或P<0.05)。二黃糖腎康低劑量組的BUN、Scr比貝那普利組明顯降低(P<0.01或P<0.05)；二黃糖腎康低劑量組的Upro與貝那普利組無(wú)顯著差異(p>0.05)；二黃糖腎康高劑量組的BUN、Scr與二黃糖腎康低劑量組無(wú)顯著差異(p>0.05)；二黃糖腎康高劑量組的Upro明顯低于二黃糖腎康低劑量組，有顯著差異(P<0.01)。(3)原位末端標(biāo)記檢測(cè)(TUNEL法)細(xì)

10、胞凋亡數(shù)目：腎小球內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)，假手術(shù)組大鼠未發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，治療組明顯低于模型組(p<0.01)，治療組組間無(wú)顯著差異；腎小管內(nèi)細(xì)胞凋亡數(shù)，模型組明顯高于假手術(shù)組(p<0.01)，治療組明顯低于模型組(p<0.01)，二黃糖腎康高劑量組與貝那普利組相比，明顯降低(P<0.05)；二黃糖腎康高、低劑量組相比，無(wú)顯著差異(p>0.05)。(4)流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白Fas及Fas-L相對(duì)含量：細(xì)胞周期結(jié)果顯示：G<,

11、0>/G<,1>期、S期、PI，治療組與模型組相比，均有顯著差異(P<0.01或P<0.05)，二黃糖腎康高、低劑量組與貝那普利組相比，二黃糖腎康高劑量組有顯著差異(P<0.05)，二黃糖腎康低劑量組無(wú)顯著差異，二黃糖腎康高、低劑量組組組間無(wú)顯著差異。G，M期，各組間無(wú)顯著差異。細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示：治療組比模型組均明顯減少(p<0.01)，二黃糖腎康高劑量組比貝那普利組明顯減少(p<0.05)，二黃糖腎康高、低劑量組組間無(wú)顯著差異。凋亡

12、相關(guān)蛋白Fas及Fas-L相對(duì)含量：治療組與模型組相比，均有顯著差異(p<0.01或P<0.05)；二黃糖腎康高、低劑量組與貝那普利組相比，亦有顯著差異(P<0.01，p<0.05)；二黃糖腎康高、低劑量組組間有顯著差異(p<0.01)。 結(jié)論：(1)二黃糖腎康能夠降低空腹血糖，改善胰島素抵抗(the insulin resistance，IR)，增加機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性。(2)二黃糖腎康能夠降低尿素氮、血肌酐、24h尿蛋白，改