NK細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)促進(jìn)因子的功能及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從探究生長(zhǎng)促進(jìn)因子在NK細(xì)胞組織特異性功能和促進(jìn)NK細(xì)胞發(fā)育和成熟過程中的作用機(jī)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制方面展開研究，獲得如下結(jié)果:
　　本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 NK細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)促進(jìn)因子促進(jìn)胚胎發(fā)育
　　本研究通過高通量基因芯片差異分析子宮trNK細(xì)胞和外周血NK細(xì)胞，篩選鑒定子宮trNK細(xì)胞組織特異性功能分子。通過熒光定量PCR、免疫熒光和流式內(nèi)標(biāo)技術(shù)檢測(cè)分析子宮trNK細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)促進(jìn)因子(

2、Growth-promoting factors，GPFs)的能力，包括多效生長(zhǎng)因子(Pleiotrophin，PTN)、骨生成誘導(dǎo)因子(Osteoglycin，OGN)和骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)。通過絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞與子宮trNK細(xì)胞共培養(yǎng)體系研究子宮trNK細(xì)胞產(chǎn)生GPFs的調(diào)控機(jī)制。最后通過檢測(cè)臨床反復(fù)流產(chǎn)病人的子宮trNK細(xì)胞分泌GPFs能力確定其與胚胎早期發(fā)育相關(guān)性，進(jìn)一步通過Ptn-/-Ogn-/-Spp1

3、-/-小鼠確認(rèn)子宮trNK細(xì)胞分泌生長(zhǎng)促進(jìn)因子促進(jìn)胚胎早期發(fā)育的重要生理意義。通過上述研究方案取得了如下結(jié)果:
　　1.基因芯片差異分析子宮trNK細(xì)胞和外周血NK細(xì)胞
　　差異分析子宮trNK細(xì)胞和外周血NK細(xì)胞的基因芯片數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示子宮trNK細(xì)胞與外周血NK細(xì)胞功能分子存在顯著差異，子宮trNK細(xì)胞特異性高表達(dá)PTN、OGN和OPN等對(duì)胚胎早期發(fā)育非常重要的生長(zhǎng)促進(jìn)因子。
　　2.子宮trNK細(xì)胞分泌生長(zhǎng)促進(jìn)因

4、子PTN，OGN和OPN
　　定量PCR、免疫熒光、流式內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果均驗(yàn)證基因芯片結(jié)果，子宮trNK細(xì)胞相較于外周血NK細(xì)胞特異性產(chǎn)生生長(zhǎng)促進(jìn)因子PTN、OGN和OPN。
　　3.HLA-G誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌生長(zhǎng)促進(jìn)因子
　　建立絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞與子宮trNK細(xì)胞共培養(yǎng)體系模擬體內(nèi)子宮trNK細(xì)胞微環(huán)境，結(jié)果顯示絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞可以促進(jìn)子宮trNK細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)促進(jìn)因子。細(xì)胞干擾和抗體阻斷實(shí)驗(yàn)及721.221-HLA-G細(xì)

5、胞系共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示，絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞過表達(dá)的HLA-G分子可以促進(jìn)子宮trNK細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)促進(jìn)因子。
　　4.反復(fù)流產(chǎn)病人NK細(xì)胞分泌生長(zhǎng)促進(jìn)因子能力顯著降低
　　分析反復(fù)流產(chǎn)病人子宮trNK細(xì)胞，結(jié)果顯示病人該細(xì)胞數(shù)量以及產(chǎn)生生長(zhǎng)促進(jìn)因子能力相較正常人均顯著減少。該結(jié)果提示，子宮trNK細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)促進(jìn)因子能力與正產(chǎn)妊娠密切相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)發(fā)育異常的胚胎相較于正常發(fā)育胚胎的HLA-G分子表達(dá)顯著降低。
　　

6、5.Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎發(fā)育受限
　　分析Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎發(fā)育情況，結(jié)果顯示生長(zhǎng)促進(jìn)因子聯(lián)合缺陷小鼠子宮trNK細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)促進(jìn)因子能力缺陷后，孕鼠胚胎發(fā)育受限，體重、體長(zhǎng)值均顯著降低。該結(jié)果提示子宮trNK細(xì)胞可以產(chǎn)生PTN、OGN等生長(zhǎng)促進(jìn)因子促進(jìn)胚胎早期發(fā)育。
　　綜上所述，該研究通過人轉(zhuǎn)錄組基因芯片，比較了子宮NK細(xì)胞和外周血NK細(xì)胞的功能基因差異，發(fā)現(xiàn)早期妊娠

7、中CD11b-CD27-子宮NK細(xì)胞高表達(dá)PTN、OGN等對(duì)胚胎早期發(fā)育非常重要的生長(zhǎng)促進(jìn)因子。胚胎來源的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)的HLA-G與子宮trNK細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)NK細(xì)胞大量表達(dá)生長(zhǎng)促進(jìn)因子，促進(jìn)胚胎發(fā)育。反復(fù)流產(chǎn)病人中子宮trNK細(xì)胞表達(dá)生長(zhǎng)促進(jìn)因子的能力顯著下降，不能支持胚胎早期的正常發(fā)育。該研究不僅豐富了NK細(xì)胞的功能，而且為臨床治療胚胎生長(zhǎng)受限和反復(fù)流產(chǎn)等相關(guān)疾病提供新的思路。
　　第二部分 PBX1通過調(diào)控生長(zhǎng)促

8、進(jìn)因子轉(zhuǎn)錄促進(jìn)NK細(xì)胞在骨髓發(fā)育成熟
　　本研究從NK細(xì)胞進(jìn)化中關(guān)鍵分子保守性的角度篩選鑒定調(diào)控NK細(xì)胞發(fā)育和成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PBX1，并且通過定量PCR，Western blotting，流式內(nèi)標(biāo)技術(shù)方法檢測(cè)分析人NK細(xì)胞體外分化擴(kuò)增體系不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞和骨髓NK細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PBX1和其潛在靶基因生長(zhǎng)促進(jìn)因子PTN和OGN的表達(dá)情況。為了研究關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PBX1的調(diào)控機(jī)制，通過電核轉(zhuǎn)技術(shù)構(gòu)建NK細(xì)胞基因干擾體系，以及通過

9、慢病毒感染構(gòu)建NK細(xì)胞體外分化擴(kuò)增過程中基因過表達(dá)體系，驗(yàn)證PBX1與生長(zhǎng)促進(jìn)因子的潛在調(diào)控相關(guān)性。為了進(jìn)一步研究PBX1調(diào)控PTN和OGN的作用機(jī)制，利用NK細(xì)胞CHIP-Seq技術(shù)，熒光素酶報(bào)告體系和DNA-pulldown體系確認(rèn)PBX1轉(zhuǎn)錄調(diào)控PTN和OGN的機(jī)制。接下來為了鑒定PBX1對(duì)NK細(xì)胞發(fā)育和成熟的調(diào)控作用，通過構(gòu)建小鼠骨髓嵌合體模型及條件型Pbx1敲除小鼠模型檢測(cè)分析NK細(xì)胞的發(fā)育和成熟情況。最后構(gòu)建Ptn-/-Og

10、n-/-小鼠模型驗(yàn)證PBX1-PTN/OGN軸對(duì)NK細(xì)胞發(fā)育和成熟的關(guān)鍵作用機(jī)制。
　　本研究通過上述研究方案取得了如下結(jié)果:
　　1.PBX1是NK細(xì)胞高度保守的轉(zhuǎn)錄因子
　　分析NK細(xì)胞關(guān)鍵分子基因在不同物種中的保守性，發(fā)現(xiàn)PBX1是NK細(xì)胞高度保守的轉(zhuǎn)錄因子。多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，人骨髓NK細(xì)胞相對(duì)T細(xì)胞特異性高表達(dá)PBX1，而且PBX1在NK細(xì)胞發(fā)育早期和成熟期均有較高表達(dá)。
　　2.PBX1調(diào)控NK

11、細(xì)胞表達(dá)PTN和OGN
　　生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，PTN和OGN基因啟動(dòng)子區(qū)富含多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子PBX1結(jié)合位點(diǎn)。NK細(xì)胞干擾和過表達(dá)PBX1基因后，流式內(nèi)標(biāo)檢測(cè)生長(zhǎng)促進(jìn)因子PTN和OGN結(jié)果顯示，在NK細(xì)胞中PBX1上調(diào)生長(zhǎng)促進(jìn)因子PTN和OGN的表達(dá)。為了進(jìn)一步研究PBX1調(diào)控機(jī)制，在NK細(xì)胞中用抗PBX1抗體富集DNA序列的CHIP-Seq分析結(jié)果顯示在PTN和OGN基因啟動(dòng)子區(qū)中分別存在轉(zhuǎn)錄因子PBX1的特異性結(jié)合峰。P

12、TN和OGN基因啟動(dòng)子區(qū)的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果和特異性序列的DNA-pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果均驗(yàn)證PBX1可以識(shí)別特異性序列，并直接結(jié)合PTN和OGN基因啟動(dòng)子區(qū)。
　　3.Pbx1缺陷小鼠NK細(xì)胞數(shù)量嚴(yán)重減少
　　對(duì)比分析小鼠骨髓嵌合體模型中Pbx1基因被干擾的骨髓細(xì)胞和未被干擾的骨髓細(xì)胞中NK細(xì)胞的比例和數(shù)量，結(jié)果顯示干擾Pbx1基因表達(dá)顯著降低骨髓NK細(xì)胞和外周NK細(xì)胞的比例和數(shù)量。分析Pbx1條件型缺陷小鼠，Vav1

13、-Cre小鼠介導(dǎo)的造血前體期Pbx1條件型缺陷嚴(yán)重影響NK細(xì)胞的發(fā)育，導(dǎo)致小鼠骨髓NK細(xì)胞和外周NK細(xì)胞的比例和數(shù)量顯著下降，與骨髓嵌合體小鼠模型結(jié)果一致。Ncr1-Cre小鼠介導(dǎo)的NK細(xì)胞成熟期Pbx1條件型缺陷同樣顯著減少成熟NK細(xì)胞在骨髓和外周的比例和數(shù)量。該結(jié)果提示，PBX1不僅可以調(diào)控NK細(xì)胞的早期發(fā)育而且對(duì)于NK細(xì)胞的成熟具有關(guān)鍵調(diào)控作用。
　　4.PBX1促進(jìn)骨髓NK細(xì)胞末端成熟
　　進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Vav1-C

14、re小鼠和Ncr1-Cre小鼠介導(dǎo)的Pbx1條件型缺陷均可以導(dǎo)致小鼠骨髓CD11b+單陽性NK細(xì)胞的比例和數(shù)量顯著減少，從而導(dǎo)致外周CD11b+單陽性NK細(xì)胞同樣比例和數(shù)量顯著減少。重組表達(dá)的生長(zhǎng)促進(jìn)因子PTN和OGN體內(nèi)和體外恢復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)充的PTN和OGN可以恢復(fù)條件型Pbx1缺陷小鼠CD11b+NK細(xì)胞的比例和數(shù)量。該結(jié)果提示，PBX1通過上調(diào)PTN和OGN促進(jìn)NK細(xì)胞自身的末端成熟。
　　5.PBX1-PTN/OGN

15、軸參與NK細(xì)胞庫(kù)的維持
　　分析Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周CD11b+單陽性NK細(xì)胞的比例和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)與Pbx1條件型缺陷小鼠結(jié)果一致，細(xì)胞的比例和數(shù)量均顯著減少。分析小鼠骨髓NK細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)因子受體的表達(dá)，結(jié)果顯示小鼠骨髓CD11b+單陽性NK細(xì)胞高表達(dá)PTN受體RPTP-β。野生小鼠骨髓細(xì)胞和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓細(xì)胞混合轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，少量的野生型小鼠骨髓細(xì)胞即可恢復(fù)Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和

16、外周中成熟NK細(xì)胞的比例和數(shù)量。重組表達(dá)的PTN和OGN體內(nèi)恢復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，補(bǔ)充PTN和OGN可以恢復(fù)Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周成熟NK細(xì)胞的比例和數(shù)量。該結(jié)果提示PBX1通過促進(jìn)PTN/OGN自分泌支持NK細(xì)胞在骨髓的發(fā)育和成熟，即PBX1-PTN/OGN軸參與體內(nèi)成熟NK細(xì)胞庫(kù)的形成和維持。
　　6.PBX1-PTN/OGN軸上調(diào)T-bet表達(dá)
　　分析Pbx1條件型缺陷小鼠和Ptn-/-Ogn-/-小鼠

17、骨髓NK細(xì)胞增殖和存活以及遷出骨髓的能力，結(jié)果顯示PBX1-PTN/OGN軸可以促進(jìn)骨髓NK細(xì)胞的增殖和遷出骨髓的能力，但不影響NK細(xì)胞存活。T-bet作為控制NK細(xì)胞末端成熟和遷出骨髓能力的重要檢查點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子，T-bet表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示在條件型Pbx1缺陷小鼠和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓NK細(xì)胞中T-bet表達(dá)顯著降低，重組表達(dá)的PTN和OGN可以顯著恢復(fù)缺陷小鼠骨髓NK細(xì)胞T-bet的表達(dá)。該結(jié)果提示，PBX1-PTN/OGN