三個病原物誘導啟動子在轉(zhuǎn)基因柑橘中受潰瘍病菌和創(chuàng)傷誘導的表達分析.pdf

1、在植物抗病基因工程育種中，利用CaMV35S等組成型啟動子調(diào)控抗性基因(如抗菌肽、病程相關(guān)蛋白、R-gene)的表達是一種常見的表達策略。但功能基因組成型表達往往會產(chǎn)生大量異源蛋白質(zhì)或?qū)е麓x產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破植物原本的代謝平衡，不利于產(chǎn)量和品質(zhì)的提高;有些代謝產(chǎn)物對植物并非必需甚至有毒害作用，阻礙了植物的正常生長，甚至導致死亡。選用合適的病原誘導啟動子控制抗病相關(guān)基因的表達，能夠定時的啟動抗性基因的表達;避免外源基因在植物體內(nèi)的

2、過量表達，進而降低甚至消除對植株生長發(fā)育的負面影響。在柑橘潰瘍病抗病基因工程研究中，很少有關(guān)于利用病原物誘導啟動子控制抗性基因提高柑橘抗性的研究報道，更沒有關(guān)于柑橘來源的病原物誘導啟動子的研究文獻。因此，如何利用其它物種來源的病原物誘導啟動子調(diào)控抗病基因，提高柑橘對潰瘍病的抗性值得研究。
　　 本文分析了來源于煙草和馬鈴薯的病原物誘導啟動子在柑橘中的表達特征，主要結(jié)果如下:
　　 1，病原誘導啟動子的克隆
　　

3、ppp1和hrs203j是來源于煙草的病原誘導啟動子，能響應(yīng)多種病原菌;gst1是來源于馬鈴薯的病原誘導啟動子，對病原菌具有廣譜的響應(yīng)。根據(jù)ppp1、gst1、hrs203j啟動子的堿基序列，設(shè)計引物。PCR擴增相應(yīng)的啟動子，通過T-克隆測序驗證，獲得了正確的啟動子序列。
　　 2，病原誘導啟動子與gus報告基因融合的植物表達載體的構(gòu)建
　　 用HindⅢ和BamHI將測序正確的啟動子從T-載體上酶切下來，連接到同樣用H

4、indⅢ和BamHI處理的pBI121載體上，構(gòu)建與gus報告基因融合的植物表達載體:PBI121-ppp1、PBI121-gst1、PBI121-hrs203j;
　　 3，三個啟動子的傷誘導表達特征分析
　　 1)GUS組織化學染色結(jié)果表明，傷誘導處理前，在ppp1和hrs203j轉(zhuǎn)基因柑橘中，未檢測到gus基因表達，而在gst1轉(zhuǎn)基因柑橘中，檢測到gus基因的本底表達;ppp1啟動子轉(zhuǎn)基因柑橘葉圓片在傷誘導處理24

5、h時染色最深，gst1啟動子轉(zhuǎn)基因柑橘葉圓片在傷誘導處理12h時染色最深，hrs203j幾乎在柑橘中不具有表達功能。
　　 2)Real-timePCR和GUS酶活分析表明，ppp1在傷誘導處理之前激活gus基因表達量很低，傷誘導處理24h，gus基因表達量和GUS酶活顯著提高;gst1在傷誘導處理前存在背景活性，傷誘導處理12h，gus基因表達量和GUS酶活明顯提高。
　　 4，三個啟動子潰瘍病細菌誘導分析
　　

6、 1)GUS組織化學染色結(jié)果表明，在未接種病原物時，在ppp1和hrs203j轉(zhuǎn)基因柑橘中，未檢測到GUS表達，而在gst1轉(zhuǎn)基因柑橘中，檢測到gus基因的本底表達;處理5d時，在ppp1轉(zhuǎn)基因葉片中出現(xiàn)藍色斑點;10d后，葉片出現(xiàn)病斑，此時藍色斑點主要集中病斑處，且ppp1和gst1都達到最高表達水平。
　　 2)Real-timePCR和GUS酶活定量分析表明，潰瘍病處理之前(0d)，ppp1激活gus基因的表達水平極低，