病原物誘導(dǎo)啟協(xié)子GST1響應(yīng)柑橘潰瘍病誘導(dǎo)的功能結(jié)構(gòu)域研究.pdf

1、柑橘潰瘍病(Citrus canker)是由地毯黃單胞桿菌柑橘致病變種(Xanthomonasnxonopodis pv.citri)引起的一種細菌性病害，目前尚無有效的方法可以根除柑橘潰瘍病。利用病原物誘導(dǎo)啟動子調(diào)控抗病基因的表達已成為植物抗病基因工程育種的主要策略之一。GST1病原誘導(dǎo)啟動子來源于馬鈴薯，對病原菌具有廣譜的響應(yīng)。在轉(zhuǎn)基因錦橙中，創(chuàng)傷和潰瘍病菌侵染能高效誘導(dǎo)GST1控制的GUS報告基因的表達。因此通過解析GST1啟動子

2、順式元件區(qū)域的功能，確定其誘導(dǎo)核心區(qū)域，為GST1啟動子改造、柑橘抗性育種等提供重要的理論依據(jù)。
　　本研究對病原物誘導(dǎo)啟動子GST1順式元件進行了功能分析，主要結(jié)果如下:
　　1.GST1啟動予的生物信息學(xué)分析
　　對長1571 bp GST1啟動子潛在的受病原菌誘導(dǎo)的順式元件進行預(yù)測分析。GST1啟動子基因組序列上含有5個W box(TTGACC/T)、3個GT1 box(GAAAAA)、12個dof box(AA

3、AG)、2個Gbox(CACNTG)、1個Sbox(AGCCACC)和1個GST1 box。
　　2.不同缺失型啟動子的克隆
　　在上述分析基礎(chǔ)上，設(shè)計4對特異性引物，5'端缺失法擴增GST1啟動子，獲得長1156bp（缺失-1571/-1158區(qū)域，產(chǎn)生的啟動子命名為G1）、746bp（缺失-1158/-748區(qū)域，產(chǎn)生的啟動子命名為G2）、314bp（缺失-747/-315區(qū)域，產(chǎn)生的啟動子命名為G3）、187bp（缺失

4、-314/-188區(qū)域，產(chǎn)生的啟動子命名為G4）缺失型啟動子4個，T-克隆，測序驗證，獲得正確的不同缺失型的啟動子序列。
　　3.不同缺失型啟動子與GUS基因融合載體的構(gòu)建
　　用HindⅢ/BamHⅠ酶切4個缺失型啟動子T-克隆載體和p1300GNGM載體，構(gòu)建不同缺失型啟動子調(diào)控GUS基因的植物表達載體:pG1∶GUS、pG2∶GUS、pG3∶GUS和pG4∶GUS。
　　4.不同缺失型啟動子轉(zhuǎn)基因植株的獲得及鑒定

5、
　　通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pG1∶GUS、pG2∶GUS、pG3∶GUS和pG4∶GUS植物表達載體轉(zhuǎn)化錦橙，經(jīng)GFP熒光檢測、PCR和Southern blot分析共獲得了36株轉(zhuǎn)基因錦橙。
　　5.不同缺失型啟動子的傷誘導(dǎo)特異性表達分析
　　對不同缺失型啟動子傷誘導(dǎo)GUS基因的表達進行qRT-PCR和GUS酶活性分析。結(jié)果表明，pG3∶GUS可高效響應(yīng)創(chuàng)傷誘導(dǎo)，pG1∶GUS、pG2∶GUS和pG4∶GUS幾乎不響應(yīng)

6、創(chuàng)傷誘導(dǎo)。
　　6，不同缺失型啟動子的潰瘍病病原菌誘導(dǎo)特異性表達分析
　　對不同缺失型啟動予潰瘍病誘導(dǎo)激活GUS基因的表達進行qRT-PCR和GUS酶活性分析。結(jié)果表明，pG3∶GUS可高效響應(yīng)潰瘍病誘導(dǎo)，pG1∶GUS、pG2∶GUS和pG4∶GUS幾乎不響應(yīng)潰瘍病誘導(dǎo)。
　　綜上所述:-1571/-1158區(qū)域和-314/-188區(qū)域的缺失顯著影響GST1啟動子受潰瘍病病原菌和創(chuàng)傷的誘導(dǎo)，這兩段區(qū)域含有正向調(diào)控潰瘍