NADPH氧化酶誘導(dǎo)H2O2與柑橘潰瘍病菌部分互作研究.pdf

1、柑橘潰瘍病(Citrus canker)是一種毀滅性的檢驗(yàn)檢疫性病害，也是柑橘上最危險(xiǎn)的病害之一，給柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，妨礙柑橘產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，引起了國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的高度重視。但不同柑橘品種間對(duì)柑橘潰瘍病的抗性有顯著性的差異，其中金柑類幾乎達(dá)到了免疫水平。研究表明，金柑在接種潰瘍病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri，Xac)后，體內(nèi)的H2O2水平上升，顯著高于其它感病品種，暗示H2O2可能與

2、其對(duì)Xac的抗性有一定關(guān)系。目前，大部分研究認(rèn)為在植物與病原互作體系中，H2O2的產(chǎn)生主要與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPHoxidase)有關(guān)。
　　NADPH氧化酶主要位于質(zhì)膜或吞噬體小膜上，是膜氧化還原系統(tǒng)的重要組成部分之一，它能催化胞質(zhì)中的NADPH將電子轉(zhuǎn)移給氧，生成活性氧(reactiveoxygen

3、 species，ROS)。ROS有超氧陰離子自由基、羥自由基、過(guò)氧羥基自由基、單線態(tài)氧、過(guò)氧化氫等多種存在形式，且這些自由基的氧化性都很強(qiáng)，并且半衰期很短，易轉(zhuǎn)化成更為穩(wěn)定的過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）。
　　NADPH氧化酶（respiratory burst oxidase homologues，rboh）基因表達(dá)量直接反映葉片中NADPH氧化酶的表達(dá)量，且NADPH氧化酶被認(rèn)為是誘導(dǎo)植物抗病過(guò)程

4、中產(chǎn)生H2O2的主要酶系，而H2O2量的差異可能導(dǎo)致不同柑橘品種之間的抗性差異，具體表現(xiàn)為Xac菌量的高低。目前，已陸續(xù)從不同植物中克隆出新的rboh基因，但研究的重點(diǎn)主要在雙子葉模式植物（如煙草、擬南芥等）上，關(guān)于柑橘的rboh基因報(bào)道較少，且對(duì)于不同品種對(duì)潰瘍病抗性的研究多側(cè)重在過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(Peroxides，POD)等參數(shù)含

5、量的變化上，但少有研究關(guān)于Xac侵染后柑橘rboh基因表達(dá)量的變化及其誘導(dǎo)H2O2與Xac之間的關(guān)系。
　　本研究的主要目的就是通過(guò)研究不同柑橘品種受Xac侵染后葉片中Xac菌量和rboh基因表達(dá)量的變化，結(jié)合H2O2的含量變化以及接種后葉片癥狀，探討NADPH氧化酶誘導(dǎo)H2O2量的差異是否是引起不同柑橘品種之間抗性差異的原因。
　　因此，本研究以對(duì)Xac具有不同抗性的四個(gè)柑橘品種金柑（Fortumellamargarita

6、）、椪柑(Citrus reticulata Ponkan)、甜橙（C.sinensis Osbeck）、葡萄柚（C.paradisi Duncan.）為材料，研究上述柑橘品種在離體條件下接種Xac后，葉片中H2O2含量、Xac菌量及rboh基因表達(dá)量的變化，旨在闡明不同品種柑橘之間抗性差異的可能原因及其與H2O2的關(guān)系。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1、不同濃度的H2O2對(duì)Xac具有不同的作用
　　離體條件下分別通過(guò)

7、平板法和液體培養(yǎng)基法測(cè)定不同濃度H2O2處理對(duì)Xac的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)500μM和5000μMH2O2處理時(shí)都有明顯的抑菌圈，而經(jīng)5μM和50μM H2O2處理時(shí)不僅沒(méi)有抑菌，反而對(duì)Xac的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。說(shuō)明高濃度的H2O2對(duì)Xac有抑制作用，而低濃度的H2O2則略有促進(jìn)作用。
　　2、抗病品種受Xac侵染后誘導(dǎo)H2O2含量較高
　　金柑、椪柑、甜橙、葡萄柚受Xac侵染后體內(nèi)H2O2水平高低依次為:金柑＞甜橙＞葡萄柚

8、＞椪柑，其中抗性品種處理組金柑的H2O2含量(5.81～9.04μM g-1FW)始終高于對(duì)照組，且明顯高于其它三個(gè)品種，而其它三個(gè)品種中則出現(xiàn)部分時(shí)段處理組H2O2水平低于對(duì)照組，其中甜橙（1.09～2.61μM g-1 FW）和葡萄柚(1.00～2.65μM g-1 FW)中的H2O2的波動(dòng)較大，椪柑的H2O2含量(0.89～1.41μMg-1 FW)波動(dòng)不大。
　　3、葉片離體接種后Xac菌量的變化與其體內(nèi)積累的H2O2含量

9、變化有一定關(guān)系
　　通過(guò)測(cè)定金柑、椪柑、甜橙、葡萄柚受Xac侵染后體內(nèi)Xac菌量的變化，發(fā)現(xiàn)金柑的Xac菌量變化最大，先是急速上升，在4 dpi時(shí)達(dá)到最大為128，后又以較快的速度下降，14 dpi時(shí)已降至16;相比其它品種，椪柑的Xac菌量（約4～16）變化不大，相對(duì)平穩(wěn)，但在5 dpi（約8）時(shí)Xac菌量迅速下降，僅為4 dpi（約16）時(shí)的一半;而甜橙（約4～160）和葡萄柚(約5～160)的Xac菌量整體呈上升趨勢(shì)。

10、>　　4、rboh基因可能與H2O2含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系
　　通過(guò)測(cè)定金柑、椪柑、甜橙、葡萄柚受Xac侵染后體內(nèi)rboh基因表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)金柑的rboh基因表達(dá)量（約0～4）的變化也是四個(gè)品種中最大的，整體呈下降趨勢(shì)，尤其在4 dpi時(shí)迅速的從2降到0.004，但在5 dpi時(shí)又迅速回到3 dpi時(shí)的水平（略低于2），8 dpi時(shí)降至0.1，此后表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，約為0.3，整體表現(xiàn)出2個(gè)低峰，與金柑H2O2含量變化的2個(gè)高峰相反;

11、椪柑rboh基因表達(dá)量(約0～2)變化相對(duì)較小，除4 dpi時(shí)表達(dá)量降到最低（約0.006）外，其余時(shí)段均穩(wěn)定在0.25～2，這與椪柑H2O2含量較低且變化不大情況吻合;甜橙(約0～2) rboh基因表達(dá)量的變化中出現(xiàn)2個(gè)低峰，而其H2O2含量變化中出現(xiàn)2次高峰;葡萄柚rboh基因表達(dá)量在4 dpi時(shí)達(dá)到最低（約0.08），而其H2O2含量在此時(shí)達(dá)到最高（約2.5μM g-1 FW），在10 dpi時(shí)葡萄柚rboh基因表達(dá)量達(dá)到最高（約