抗小麥黃矮病候選基因的克隆、特性分析及病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子的分離.pdf

1、小麥黃矮病(wheat yellow dwarf disease，WYD)是小麥的主要病害之一，由蚜蟲傳播的大麥黃矮病毒(BYDV)引起，常造成巨大損失。小麥的近緣種-中間偃麥草對(duì)大麥黃矮病毒具有高度抗性，它至少包含三個(gè)抗黃矮病基因，分別定位于7St、7E和2Ai-2染色體上。其中有一個(gè)基因被精確定位在中間偃麥草7X(St)染色體長(zhǎng)臂端部，被命名為Bdv2。通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交與生物技術(shù)已將中間偃麥草的黃矮病抗性基因(Bdv2)導(dǎo)入普通小麥基因

2、組，選育出抗黃矮病的小麥-中間偃麥草易位系HW642等。但是該抗性基因介導(dǎo)的抗黃矮病反應(yīng)分子機(jī)制尚待研究。研究表明，植物抗病基因編碼的蛋白質(zhì)決定著寄主植物能否打開(kāi)抗病系統(tǒng)或打開(kāi)該系統(tǒng)的程度，真正起抗病作用的是誘導(dǎo)表達(dá)的防御基因的產(chǎn)物。因此在抗病植株中篩選和分離BYDV誘導(dǎo)表達(dá)的基因，并分析它們的功能，可為揭示小麥抗黃矮病分子機(jī)制和抗病基因工程高效育種開(kāi)辟新途徑，保證小麥的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)具有非常重要的意義。 本研究利用cDNA-AFLP

3、技術(shù)篩選出BYDV誘導(dǎo)的特異表達(dá)片段，設(shè)計(jì)特異引物，利用3RACE技術(shù)、篩選BYDV誘導(dǎo)的cDNA文庫(kù)和5RACE技術(shù)，克隆了兩個(gè)抗小麥黃矮病的候選基因P38M16和P6M3的cDNA全長(zhǎng)序列。候選基因P38M16cDNA全長(zhǎng)序列為3218bp,其中ORF為1938bp，編碼646個(gè)氨基酸。候選基因P6M3在抗病小麥HW642和中間偃麥草Ti中均擴(kuò)增出包含全長(zhǎng)ORF序列，分別暫命名為TaP6M3與TiP6M3。TaP6M3 cDNA全長(zhǎng)

4、序列為4106bp，其中ORF為3180bp，編碼1060個(gè)氨基酸；TiP6M3長(zhǎng)4072bp，其中ORF為3096bp，編碼1032個(gè)氨基酸。TaP6M3與TiP6M3的eDNA序列一致性為92.19％，氨基酸一致性為88.89％。通過(guò)在NCBI(http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/blast)中的blastP分別對(duì)兩候選基因全長(zhǎng)cDNA序列編碼的氨基酸序列進(jìn)行了保守結(jié)構(gòu)域的搜索，結(jié)果表明，兩基因編碼的產(chǎn)物均具有N

5、BS、LRR等一系列抗病基因的保守結(jié)構(gòu)域，表明兩基因編碼的蛋白為NBS-LRR抗病類似蛋白。 利用半定量RT-PCR的方法對(duì)克隆的兩個(gè)候選基因進(jìn)行表達(dá)分析表明，兩候選基因均屬組成型表達(dá)，不受BYDV、SA和JA誘導(dǎo)。對(duì)P38M16基因在小麥抗感材料和中間偃麥草基因組中分布情況分析，結(jié)果表明在中間偃麥草和抗病易位系HW642中均有6個(gè)拷貝，而在感病小麥中8601中只有5個(gè)拷貝。 構(gòu)建了病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)載體，為在

6、小麥上建立病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系作準(zhǔn)備，為快速分析小麥及其近緣種新基因的功能提供新的有力工具。 植物基因的表達(dá)調(diào)控已成為分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)，啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式元件，啟動(dòng)子的克隆對(duì)研究基因表達(dá)調(diào)控、構(gòu)建基因工程載體、表達(dá)目的蛋白有著重要的意義。GLU，ERFlb為病原誘導(dǎo)的小麥基因。為克隆小麥GLU，ERFlb基因的啟動(dòng)子，將小麥基因組DNA分別用HindⅢ酶切，酶切片段與一特殊的銜接頭連接。取連接產(chǎn)物作模板，以銜接頭

7、引物和基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將HindⅢ．銜接頭體系的PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序。對(duì)抗病相關(guān)啟動(dòng)子的克隆用銜接頭PCR方法進(jìn)行了摸索，分離出部分啟動(dòng)子序列，由于六倍體普通小麥的基因組規(guī)模較大，重復(fù)序列多，單靠一端序列向5端延伸，經(jīng)常會(huì)發(fā)生偏離。實(shí)驗(yàn)室將在以后的試驗(yàn)中再利用其它啟動(dòng)子的克隆方法進(jìn)行摸索，以獲得啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列，并構(gòu)建分離的啟動(dòng)子-GUS嵌合基因表達(dá)載體及其在植物組織中的瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)，隨后將分離的啟動(dòng)子與抗病相關(guān)基因構(gòu)建到單子