兩個(gè)玉米紋枯病病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子中核心順式作用元件的鑒定.pdf

1、由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起的玉米紋枯病是世界上玉米產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生、危害嚴(yán)重的病害之一。隨著種植密度的提高和高產(chǎn)栽培技術(shù)的發(fā)展，玉米紋枯病有逐年加重的趨勢(shì)。玉米紋枯病已經(jīng)成為阻礙我國(guó)玉米高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、增產(chǎn)的主要限制因素。然而，由于紋枯病抗性資源匱乏，利用主效抗病基因來培育抗病品種受到局限。啟動(dòng)子是決定基因活動(dòng)的“開關(guān)”，利用病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗病相關(guān)基因進(jìn)行基因工程育種也是一種有效的途徑。
　　此

2、前實(shí)驗(yàn)室已對(duì)兩個(gè)紋枯病病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子PGRMZM2G315431和PGRMZM2G174449進(jìn)行了功能研究，通過截短實(shí)驗(yàn)粗略鑒定到三個(gè)攜帶紋枯病病原誘導(dǎo)核心順式作用元件的區(qū)段，且均未在區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)已知的病原誘導(dǎo)元件。本研究通過對(duì)三條序列進(jìn)行相似性分析發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)相似序列，GT/CTGA與TATT/AT，兩者共同存在于PGRMZM2G315431-1243--1228中，且分別存在于PGRMZM2G174449-490--478與PGRMZ

3、M2G174449-574--550之中，從而確定為候選順式作用元件進(jìn)行功能驗(yàn)證。
　　通過煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，在接種玉米紋枯病菌后對(duì) GFP熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：GTTGA元件能夠響應(yīng)病原菌的誘導(dǎo)，并啟動(dòng)下游報(bào)告基因的表達(dá)，而將PGRMZM2G315431-1243--1228中的GTTGA元件缺失掉之后，啟動(dòng)子片段對(duì)病原菌的響應(yīng)情況減弱，但并未完全喪失。由此說明GTTGA元件參與到紋枯病菌的響應(yīng)途徑中，而在PGRMZM2G315

4、431-1243--1228中除GTTGA外可能還存在另外一個(gè)受紋枯病菌誘導(dǎo)的順式作用元件，這與之前的相似性分析不謀而合。之后在轉(zhuǎn)基因水稻穩(wěn)定表達(dá)體系中接種玉米紋枯病菌，同樣證明GTTGA元件能夠被紋枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)。將GTTGA點(diǎn)突變?yōu)镚CTGA后，在煙草葉片中仍能檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光信號(hào)，說明該突變位點(diǎn)不是順式作用元件病原誘導(dǎo)活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。此外，對(duì)GTTGA元件重復(fù)次數(shù)對(duì)其響應(yīng)能力的影響進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，重復(fù)兩次與三次后，相較于一次重復(fù)，

5、病原誘導(dǎo)活性明顯上升，但兩者相差不大，由此可見，元件經(jīng)串聯(lián)重復(fù)后誘導(dǎo)活性可以得到提高，但并非無限制累積。將與此相仿，TATAT元件在煙草中瞬時(shí)表達(dá)后能夠檢測(cè)到熒光信號(hào)；而將 PGRMZM2G174449-574--550中的TATAT元件缺失掉之后，基本檢測(cè)不到GFP熒光，說明TATAT元件也是一個(gè)受紋枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)的元件。該結(jié)果利用穩(wěn)定的水稻轉(zhuǎn)基因體系也得到證明。將 TATAT點(diǎn)突變?yōu)?TATTT后，在煙草葉片中仍能檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光信