丙泊酚對(duì)膿毒癥小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞亞群及TNF-α、IL-10水平的影響.pdf

1、目的：本研究采用盲腸結(jié)扎法（CLP）建立膿毒癥小鼠模型，對(duì)比觀察內(nèi)毒素組和丙泊酚治療組小鼠各時(shí)相點(diǎn)樹突狀細(xì)胞的數(shù)目、成熟度以及亞型，此外還同時(shí)檢測(cè)各時(shí)相點(diǎn) TNF-α和IL-10的水平，以綜合評(píng)估各時(shí)相點(diǎn)炎癥狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)從丙泊酚能誘導(dǎo)膿毒癥小鼠樹突細(xì)胞向調(diào)節(jié)性樹突細(xì)胞分化角度闡釋丙泊酚對(duì)膿毒癥免疫平衡的影響，以期為麻醉鎮(zhèn)靜藥物在 ICU的合理應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：將60只 BalB/c小鼠隨機(jī)均分為三組即假手術(shù)組（Sham組）

2、、丙泊酚注射組（P組）和生理鹽水注射組（NS組），其中 P組和NS組按盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥小鼠模型，而假手術(shù)組僅開腹翻動(dòng)盲腸。造模成功后，生理鹽水組和丙泊酚組分別給予等量的0.9％生理鹽水和丙泊酚（按照15mg/kg計(jì)算注射量）腹腔注射,Sham組不作任何處理，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在造模成功后的0h、6h、12h、24 h和36h處死，每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)處死4只小鼠；在設(shè)定好的每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)將實(shí)驗(yàn)小鼠眼球取血待后續(xù)檢測(cè)細(xì)胞因子，然后用脊髓脫頸法處死

3、小鼠后留取脾臟，去除被膜后剪碎并研磨；收集細(xì)胞懸液加入到小鼠淋巴細(xì)胞分離液上，離心后留取中層絮狀物，緩沖液再次重懸，離心后去除多余的淋巴細(xì)胞分離液；使用 DCs陰選試劑盒分選獲得 DCs，通過添加抗 CD11c、CD45RB磁珠選出 CD11clowCD45RBhigh DCs，將純化的CD11clowCD45RBhigh DCs孵育24h，離心留取孵育液上清保存待檢測(cè)細(xì)胞因子；將獲得的 DCs用 PBS重懸后加入 CD11c-APC、

4、CD45RB-PE抗體標(biāo)染， CD40-FITC、CD80-FITC、CD86-FITC、I-a/e-FITC，避光孵育15min采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC亞群分化及細(xì)胞表面相關(guān)標(biāo)記物；嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書測(cè)定實(shí)驗(yàn)中涉及的細(xì)胞因子TNF-α及IL-10的濃度。
　　結(jié)果：1流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞分成了CD11chighCD45RBlowD Cs（傳統(tǒng)性樹突狀細(xì)胞）、CD11clowCD45RBhighDC

5、s（調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞）和CD11clowCD45RBlowDCs三個(gè)亞群；2經(jīng)過同型對(duì)照流式細(xì)胞儀對(duì)調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞 C D11clowCD45RBhighDCs表面分子檢測(cè)后發(fā)現(xiàn) CD40、CD80、CD86和MHC-II類分子等均處于低度表達(dá)或者弱表達(dá)狀態(tài)，符合 CD11clowCD45RBhighDCs的不成熟特性；3與生NS組比較，0~6h時(shí)P組R1（傳統(tǒng)性樹突狀細(xì)胞CD11chighCD45RBlow DCs）和R2（調(diào)節(jié)性樹

6、突狀細(xì)胞CD11clowCD45RBhighDCs）所占比例變化并沒有顯著變化，從12h開始，兩組中 R1所占比例變化不明顯，而 P組的 R2比例比 NS組明顯升高（P<0.05），在24h~36h，P組的R2比例仍舊比NS組顯著增加（P<0.
　　05）；4膿毒癥模型組小鼠血清中IL-10和TNF-α水平均較Sham組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而在經(jīng)過丙泊酚的刺激后，該組血清中 TNF-α水平較NS組明顯下降同

7、時(shí)IL-10水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；5經(jīng)Pears on直線相關(guān)性分析表明，P組CD11clowCD45RBhighDCs比例增加與孵育液中IL-10水平呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)（r=0.355，P<0.05）。
　　結(jié)論：1膿毒癥早期無論是促炎因子TNF-α還是抗炎因子IL-10均有一定程度的升高，說明此時(shí)機(jī)體免疫處于失衡狀態(tài)。2膿毒癥早期丙泊酚的應(yīng)用可以促使脾臟樹突狀細(xì)胞向調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞分化，并在一定程度上抑