SELEX技術(shù)篩選鈣通道特異性核酸適配體及其抗肥大細(xì)胞活化的作用.pdf

1、目的和方法:
　　鈣內(nèi)流是肥大細(xì)胞活化的充分必要條件。肥大細(xì)胞鈣內(nèi)流由鈣釋放激活鈣離子(calcium release activation calcium,CRAC)通道介導(dǎo)。構(gòu)成CRAC功能的兩個(gè)蛋白為Orai1和STIM1(stromal interaction molecule1)。阻止肥大細(xì)胞鈣內(nèi)流有可能抑制肥大細(xì)胞活化從而有可能用于過(guò)敏治療。指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of liga

2、nd by exponential enrichment,SELEX)技術(shù)篩選的適配體以其高親和力高特異性,在臨床上顯示了廣泛和潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究利用 SELEX技術(shù)篩選針對(duì)Orai1蛋白第1膜外區(qū)的核酸適配體,利用IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞系LAD2脫顆粒模型,研究核酸適配體對(duì)肥大細(xì)胞鈣通道的抑制效應(yīng),探討核酸適配體通過(guò)抑制鈣內(nèi)流進(jìn)而阻止肥大細(xì)胞活化的可能性。本研究分為三部分:(1)培養(yǎng)人肥大細(xì)胞系LAD2細(xì)胞,生物素標(biāo)記的IgE致敏,

3、1分子鏈霉親和素能結(jié)合4分子生物素,從而發(fā)揮多價(jià)抗原的作用,用鏈霉親和素攻擊建立LAD2細(xì)胞脫顆粒模型,優(yōu)化IgE最佳致敏濃度,并以組胺和β-氨基己糖苷酶釋放為指標(biāo)檢測(cè)肥大細(xì)胞活化效果;(2)通過(guò)序列比對(duì)確認(rèn)Orai1蛋白第1膜外區(qū)的11個(gè)氨基酸具有Orai1蛋白特異性。針對(duì)該Orai1蛋白第1膜外區(qū),采用酶聯(lián)板為篩選介質(zhì)的SELEX技術(shù),從人工合成隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)中篩選并制備核酸適配體。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)適配體與靶蛋白的特異性結(jié)合

4、及親和力常數(shù)(Kd值);(3)用激光共聚焦顯微鏡觀察核酸適配體對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化的影響,以LAD2細(xì)胞脫顆粒模型檢測(cè)核酸適配體對(duì)肥大細(xì)胞過(guò)敏介質(zhì)釋放的抑制效果,從而觀察核酸適配體對(duì)肥大細(xì)胞活化的抑制效應(yīng),探討針對(duì)CRAC新靶點(diǎn)抑制過(guò)敏反應(yīng)的新機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.建立了人肥大細(xì)胞系LAD2細(xì)胞的培養(yǎng)體系及其脫顆粒模型:LAD2細(xì)胞倍增時(shí)間為10天,LAD2細(xì)胞染色和電鏡觀察細(xì)胞核周圍含有大量大小不等顆粒。在密度為1×1

5、06細(xì)胞/mL的培養(yǎng)體系中,優(yōu)化了生物素標(biāo)記的IgE的致敏濃度為500ng/mL,鏈霉親和素攻擊濃度為1000ng/mL。在優(yōu)化濃度作用下,培養(yǎng)體系中的肥大細(xì)胞活化效果最佳。
　　2.SELEX篩選共進(jìn)行了12輪,各輪產(chǎn)物與Orai1蛋白親和力呈逐漸升高趨勢(shì),于第11輪序列達(dá)到最高值。以第11輪富集庫(kù)序列為基礎(chǔ)獲得了7條核酸適配體,其中AptamerY1親和力最高。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)證實(shí)了AptmerY1可與Oari1特異性結(jié)合。A

6、ptamerY1親和力常數(shù)(Kd值)為1.72×10-8mol/L。
　　3.上述步驟制備的AptamerY1可抑制IgE介導(dǎo)的人肥大細(xì)胞系LAD2脫顆粒模型,激光共聚焦顯微鏡觀察AptamerY1明顯抑制了LAD2鈣離子內(nèi)流。AptamerY1對(duì)LAD2細(xì)胞的β-氨基己糖苷酶釋放抑制率達(dá)95％。說(shuō)明AptamerY1抑制肥大細(xì)胞β-氨基己糖苷酶釋放是通過(guò)抑制CRAC介導(dǎo)的肥大細(xì)胞鈣內(nèi)流所致。
　　主要結(jié)論:
　　建立