肥大細(xì)胞膜機(jī)械敏感性離子通道的研究.pdf

1、目的:
　　 研究人肥大細(xì)胞系(HMC-1)機(jī)械敏感性離子通道的電學(xué)特性;建立適用于膜片鉗記錄的外周組織片模型,并進(jìn)一步對其中原位肥大細(xì)胞(mast cell,MC)的機(jī)械敏感性進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 方法:
　　 (1)在光鏡顯微鏡下觀察低滲環(huán)境導(dǎo)致HMC-1細(xì)胞處于高應(yīng)力狀態(tài)中對該細(xì)胞脫顆粒的影響。
　　 (2)利用熒光成像技術(shù),以鈣綠(Calcium Green-1 AM)為熒光指示劑,測量低滲環(huán)境中HM

2、C-1胞內(nèi)Ca2+濃度I)的變化。
　　 (3)在膜片鉗外面朝外(outside-out)和細(xì)胞吸附(cell-attached)兩種模式下,通過膜片鉗記錄電極對細(xì)胞膜施加正壓(+30～+60cmH2O)或負(fù)壓(-60～-30cmH2O)刺激,測量和分析HMC-1上張力激活性(stretch-activated,SA)離子通道的單通道特性。
　　 (4)制備大鼠“后三里”穴區(qū)(ST36)皮下結(jié)締組織片,用甲苯胺藍(lán)(Tol

3、uidine blue,TB)或中興紅(Neutral red,NR)染色觀察組織片內(nèi)MCs的分布,并用膜片鉗全細(xì)胞(whole-cell)模式對組織片內(nèi)原位MCs的SA電流進(jìn)行記錄。
　　 結(jié)果:
　　 (1)在230mOsm/kg的低滲細(xì)胞外液中,處于穩(wěn)定狀態(tài)的HMC-1細(xì)胞會在5～30分鐘內(nèi)出現(xiàn)脫顆?，F(xiàn)象,脫顆粒率為54.9±8.5％(n=4個獨(dú)立實(shí)驗(yàn),P≤0.01)(mean±SEM)。低滲環(huán)境導(dǎo)致HMC-1脫顆

4、粒效應(yīng)可被C1-通道阻斷劑DIDS和香草精受體TRPV2阻斷劑SKF96365抑制,脫顆粒率分別下降到17.7±5.4％(n=4個獨(dú)立實(shí)驗(yàn),P≤0.05)和22.2±7.9％(n=2個獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。
　　 (2)250mOsm/kg的低滲細(xì)胞外液能增加HMC-1胞內(nèi)相對鈣熒光強(qiáng)度,熒光強(qiáng)度從對照組的100％上升到116.7±3.6％(n=52,5個獨(dú)立實(shí)驗(yàn),P≤0.01)。TRPV蛋白阻斷劑釘紅(ruthenium red,RuR

5、)、SKF96365和DIDS能取消或抑制該增強(qiáng)效應(yīng),胞內(nèi)相對鈣熒光強(qiáng)度分別下降到100.3±0.9％(n=41,3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn),P≥0.01)、103.7±3.2％(n=30,3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn),P≤0.05)和67.8±5.2％(n=29,4個獨(dú)立實(shí)驗(yàn),P≤0.01)。
　　 (3)在膜片鉗實(shí)驗(yàn)中,直接的壓力牽張可激活HMC-1細(xì)胞SA通道。SA單通道電流表現(xiàn)出較強(qiáng)的外向整流性。+100mV膜電位下的通道電導(dǎo)為55.1±3.4pS(

6、n=38)。SA通道的開放概率(open probability,Po)具有電壓依賴性,在正膜電位下急劇增大;并且具有壓力依賴性,Po隨著外界壓力的增加而增大,在+20mV膜電位下,達(dá)到最大Po值一半所需的壓力為26.4cmH2O。在+60mV膜電位下,通道開放時間分布(open-time distribution)能被3個指數(shù)函數(shù)擬合,時間常數(shù)分別為τ1o=755.1ms、τ2o=166.4ms和τ3o=16.5ms;通道關(guān)閉時間分布

7、(closed-time distribution)也能被3個指數(shù)函數(shù)擬合,時間常數(shù)分別為τ1c=661.6ms、τ2c=253.2ms和T3c=5.6ms。
　　 (4)HMC-1細(xì)胞的SA單通道活動具有細(xì)胞外Cl-濃度([Cl-]。)依賴性(n=9)。當(dāng)[Cl-]。由169mM降低到19mM后,+100mV膜電位下的電導(dǎo)從44.2±4.4pS下降到15.1±1.6pS(P≤50.01)。在+60mV膜電位下,Po降低到對照組

8、的62.2±13.6％(P≤0.01)。V1/2從5.5±2.7mV上升到45.6±6.9mV。
　　 (5)HMC-1細(xì)胞SA單通道活動可被Cl-通道阻斷劑DIDS可逆性抑制(n=9)。+100mV膜電位下的電導(dǎo)從58.5±4.1pS下降到18.9±7.0pS(P≤0.01)。+60mV膜電位下,Po降低到對照組的20.6±1.4％(P≤0.01)。
　　 (6)用細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B,CB)斷裂

9、細(xì)胞骨架后發(fā)現(xiàn),激活SA通道所需的壓力降低。
　　 (7)大量MCs分布在大鼠“后三里”穴區(qū)(ST36)的皮下結(jié)締組織片內(nèi)。和HMC-1類似,大鼠原位MCs也同樣表達(dá)機(jī)械敏感性離子通道。SA通道的全細(xì)胞電流表現(xiàn)出外向整流性,并隨外界壓力的增加而增大。+100mV膜電位下,由-60cmH2O激活的SA通道的電導(dǎo)為83.2±25.5pS,翻轉(zhuǎn)電位約為.35.8mV。
　　 結(jié)論:
　　 HMC-1脫顆粒效應(yīng)可被機(jī)械刺