粉塵對巨噬細(xì)胞膜離子通道影響研究及粉塵采樣測定標(biāo)準(zhǔn)方法修訂探討.pdf

1、矽肺的發(fā)生發(fā)展是多因素相互作用的結(jié)果,盡管發(fā)病和機(jī)理尚未完全清楚,但目前一般認(rèn)為,二氧化硅對以肺泡巨噬細(xì)胞(AM)膜為主的生物膜損傷,是矽肺發(fā)生發(fā)展的重要起因。本部分主要從(1)不同粉塵對巨噬細(xì)胞膜的損傷作用機(jī)制以及(2)粉塵對巨噬細(xì)胞膜鉀離子通道的影響兩個(gè)方面進(jìn)行研究,以探討巨噬細(xì)胞膜鉀離子通道在粉塵顆粒致肺損傷中的作用機(jī)制。
　?、癫煌蹓m對巨噬細(xì)胞膜的損傷作用機(jī)制研究
　　第一部分
　　目的:以巨噬細(xì)胞為對象,探

2、討二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)、柴油廢氣顆粒物(diesel exhaust particles,DEPs)和納米顆粒物(Nano particles,NPs)等不同顆粒物對巨噬細(xì)胞的損傷作用及其機(jī)制。
　　方法:肺泡灌洗獲得巨噬細(xì)胞,通過MTT法觀察SiO2、DEPs和NPs對巨噬細(xì)胞存活率的影響;檢測SiO2、DEPs和NPs對巨噬細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物丙二醛(malonyldialdehyde,MDA)生

3、成量和細(xì)胞內(nèi)超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的活性以及培養(yǎng)上清液中一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;用激光共聚焦技術(shù)檢測SiO2、DEPs和NPs對巨噬細(xì)胞胞內(nèi)鈣濃度的影響。
　　結(jié)果:(1)200μg/ml SiO2對巨噬細(xì)胞存活率的影響具有時(shí)間依賴性,

4、作用6h,12h,18h,24h后,巨噬細(xì)胞存活率分別為77.5％±6.8%,65.1%±14.7%,46.1%±10.2%,18.3%±5.5%;200μg/ml DEPs對巨噬細(xì)胞存活率的影響也具有時(shí)間依賴性,作用6h,12h,18h,24h后,巨噬細(xì)胞存活率分別為66.9%±6.8%,50.2%±6.6%,46.9%±7.3%,42.8%±13.2%,DEPs對巨噬細(xì)胞毒性作用時(shí)間快; NPs對細(xì)胞存活率的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、r>　　(2)用100μg/ml的SiO2、DEPs和NPs孵育細(xì)胞24h,SiO2、DEPs和NPs使巨噬細(xì)胞內(nèi)MDA含量由13.14±3.66nmol/mgprot分別增加到24.21±4.52nmol/mgprot(上升84.2%)、47.03±6.98nmol/mgprot(上升257.9%)、26.30±0.63nmol/mgprot(上升100.1%);100μg/ml的SiO2、DEPs和NPs使巨噬細(xì)胞內(nèi)SOD活性分別下

6、降77.5%、70.2%、63.3%;使培養(yǎng)上清液NO含量分別增加89.4%、160.8%、39.9%,使巨噬細(xì)胞內(nèi)NOS活性分別增加157.9%、273.2%、12.1%;SiO2和DEPs使巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS活性分別增加126.6%、848.6%,而NPs使iNOS活性降低24.8%。
　　結(jié)論:(1) SiO2和DEPs顯著性降低巨噬細(xì)胞存活率,而NPs對巨噬細(xì)胞存活率的影響不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)粉塵SiO2、D

7、EPs和NPs參與了巨噬細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),且不同粉塵反應(yīng)程度不一,SiO2和DEPs可能通過氧化應(yīng)激損傷使巨噬細(xì)胞存活率降低。
　　(3)SiO2和DEPs促巨噬細(xì)胞凋亡進(jìn)而使細(xì)胞存活率降低。
　　(4)SiO2和DEPs促胞內(nèi)鈣增加影響鈣穩(wěn)態(tài),而NPs對胞內(nèi)鈣沒有影響。
　　(5)SiO2和DEPs使巨噬細(xì)胞存活率降低的分子機(jī)制可能與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。粉塵通過多種途徑降低巨噬細(xì)胞存活率而產(chǎn)生損傷

8、作用,且對于不同類型的粉塵,引起存活率降低的機(jī)制和具體過程不完全一致。
　　第二部分
　　目的:探討用膜片鉗技術(shù)記錄大鼠肺泡巨噬細(xì)胞鉀通道電流以及鉀通道動(dòng)力學(xué)基本特性;研究石英粉塵對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞電壓依賴性鉀通道電流的影響以及對通道動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的影響,并比較石英粉塵、玻璃態(tài)石英粉塵對巨噬細(xì)胞膜鉀通道的不同作用。
　　方法:選擇健康SD大鼠,用肺灌洗方法收集肺泡巨噬細(xì)胞,石英粉塵按濃度分為5個(gè)組(0、25、50、100、

9、200μg/ml),將載有AM的玻片置于含不同濃度粉塵的細(xì)胞外液中培養(yǎng)24小時(shí),選取直徑約為15μm AM細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象,以不加粉塵培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞為陰性對照,用膜片鉗全細(xì)胞技術(shù)記錄不同電壓刺激下的細(xì)胞膜鉀電流值,運(yùn)用pCLAMP9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和資料分析。
　　結(jié)果:(1)在大鼠肺泡巨噬細(xì)胞上記錄到了3種鉀電流表現(xiàn)形式,即內(nèi)向整流鉀電流,外向整流鉀電流,內(nèi)外向皆表達(dá)的鉀電流。
　　(2)實(shí)驗(yàn)最佳參數(shù)依次為:鉗制電壓為-

10、60mV,刺激范圍-180mV-60mV,以20mV躍遷的方波刺激300ms,記錄內(nèi)向整流鉀電流和外向延遲整流鉀電流;電極入水阻抗在4-5MΩ,入水正壓在0.2ml,串聯(lián)電阻不宜超過入水阻抗的4倍,封接電阻需在1GΩ以上。
　　(3)在AM膜超極化電壓范圍(-180mV~-60mV)內(nèi)均可激活內(nèi)向電流,復(fù)極化電壓范圍(-60mV~60mV)內(nèi)均可激活外向電流。-180mV電壓可最大激活內(nèi)向鉀電流,峰電流-179.19±71.59(

11、pA),電流密度-17.61±8.33(pA/pF)。60mV電壓可最大激活外向電流,峰電流196.23±96.88(pA),電流密度20.14±10.38(pA/pF)。
　　(4)各記錄時(shí)間的峰電流與0時(shí)峰電流的比較,多種指標(biāo)分別做單因素方差分析,鉀電流在10分鐘內(nèi)均沒有明顯的電流衰減現(xiàn)象(P>0.05)。
　　(5)細(xì)胞破膜后,靜息電位在10分鐘內(nèi)均沒有明顯變化(P>0.05)。
　　(6)當(dāng)石英濃度為25μg/

12、ml(n=14)、50μg/ml(n=8)、100μg/ml(n=10,p<0.05)時(shí),外向延遲鉀電流顯著增大(p<0.05)。可使I-V曲線顯著增加,即隨膜電位的升高電流增加的程度越大。
　　(7)石英對外向延遲鉀通道均電流的影響:對照組v/2=-1.41±2.83mV,k=26.74±2.84,當(dāng)石英濃度為25μg/ml時(shí),v/2=1.57±2.72 mV,k=25.01±2.66,當(dāng)石英濃度為50μg/ml,v/2=8.2

13、1±2.67mV,k=24.17±2.61,激活曲線右移,并使激活曲線的斜率減小;當(dāng)石英濃度為100μg/ml時(shí),v/2=-28.41±2.30mV,k=17.62±2.21,激活曲線非常顯著左移,并使激活曲線的斜率增大(P=0.0049,R2=0.96)。
　　(8)石英對巨噬細(xì)胞外向延遲鉀通道峰電流影響:當(dāng)石英濃度為25μg/ml時(shí),v/2=11.86±2.60 mV,k=21.14±2.45,當(dāng)石英濃度為50μg/ml,v/

14、2=23.60±1.26 mV,k=2.43±0.74,激活曲線右移,并使激活曲線的斜率減小;當(dāng)石英濃度為100μg/ml時(shí),v/2=-28.68±2.89mV,k=23.52±2.97,激活曲線非常顯著左移,并使激活曲線的斜率增大(P=0.00525,R2=0.9628)。這與石英對外向延遲鉀通道均電流的影響相一致。
　　(9)石英對內(nèi)向整流鉀通道均電流、內(nèi)向整流鉀通道峰電流都產(chǎn)生影響,并使二者激活曲線非常顯著右移,即半激活電壓

15、V1/2增大,而對斜率K值沒有影響。當(dāng)石英濃度為100μg/ml(n=10)時(shí),內(nèi)向整流鉀電流顯著變小(p<0.05)。
　　結(jié)論:(1)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜存在電壓門控鉀通道,其通道開放在10分鐘內(nèi)不隨時(shí)間延長而發(fā)生衰減。
　　(2)石英對外向鉀電流的增加作用具有電壓依賴性,可使I-V曲線顯著增加,即隨膜電位的升高電流增加的程度越大。
　　(3)石英粉塵對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞外向延遲鉀電流有激活作用。
　　(4)石英

16、粉塵對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流有抑制作用。
　　(5)不同濃度的石英均可使巨噬細(xì)胞鉀電流反轉(zhuǎn)電位發(fā)生顯著性變化,即通道性質(zhì)發(fā)生變化。
　　(6)石英粉塵對不同鉀電流的激活和抑制,并改變離子通道門控動(dòng)力學(xué)以及激活曲線過程,可能是其致巨噬細(xì)胞損傷機(jī)制之一。
　　粉塵是工作場所中最常見的職業(yè)危害因素,粉塵所致塵肺病是我國最主要的職業(yè)病,不僅患病人數(shù)多,而且危害大,是嚴(yán)重致勞動(dòng)能力降低、致殘和影響壽命的疾病,也是國家和企

17、業(yè)賠償?shù)闹饕殬I(yè)病。我國現(xiàn)有累積塵肺病例接近60萬人,近15年平均每年新發(fā)塵肺病近萬例,塵肺病占職業(yè)病報(bào)告例數(shù)的71%。粉塵監(jiān)測為粉塵防治工作的先導(dǎo),只有監(jiān)測方法和數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確可靠,隨后的防、降塵措施才有可能見到成效,因此,科學(xué)的粉塵監(jiān)測方法標(biāo)準(zhǔn)至關(guān)重要。按照我國標(biāo)準(zhǔn)化法的有關(guān)規(guī)定,國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)一般修訂周期不超過5年,《作業(yè)場所空氣中粉塵測定方法》(GB5748-85)已經(jīng)20余年沒有修訂。我國工作場所空氣中粉塵監(jiān)測方法的研究經(jīng)歷

18、了幾個(gè)階段,二十世紀(jì)50年代至60年代中期,主要是仿制、引進(jìn)和應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)研制各種采樣器,60年代末,測塵則已用濾膜重量法,并開始應(yīng)用轉(zhuǎn)子流量計(jì)。80年代,對所用濾膜進(jìn)行了改進(jìn)、探討和研制,90年代開展呼吸性粉塵檢測,近些年來主要開展粉塵的時(shí)間加權(quán)平均濃度測定方法研究。本部分從呼吸性粉塵濃度現(xiàn)場監(jiān)測質(zhì)量控制分析、粉塵中游離SiO2含量測定方法的影響因素以及粉塵監(jiān)測方法國家標(biāo)準(zhǔn)修訂探討三個(gè)方面進(jìn)行研究,以期對我國粉塵檢測方法的修訂提供基礎(chǔ)資