基于cell-SELEX技術(shù)對(duì)從膽管癌細(xì)胞株QBC-939的核酸適配體篩選.pdf_第1頁(yè)
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1、肝門(mén)部膽管癌(HCCA)是一種膽道系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤,由于其發(fā)生部位特殊,呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)及與肝門(mén)部血管關(guān)系密切等特點(diǎn),給手術(shù)切除造成極大的困難。目前肝門(mén)部膽管癌的臨床發(fā)現(xiàn)和診斷方法主要是建立在影像學(xué)方法上,用來(lái)檢查組織細(xì)胞的形貌。這種方法存在靈敏度不高,特異性差等缺陷。因此,發(fā)展具有高特異性和高靈敏度的分子識(shí)別探針實(shí)現(xiàn)對(duì)肝門(mén)部膽管癌的早期檢測(cè)和診斷、腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、腫瘤發(fā)病機(jī)理研究具有非常重要的意義。核酸適配體是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型

2、分子識(shí)別探針,具有識(shí)別范圍廣、穩(wěn)定性好、分子量小、易于修飾等特點(diǎn),目前在分析化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等許多領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用。
   本文利用cell-SELEX技術(shù),開(kāi)展了對(duì)人膽管癌細(xì)胞株QBC-939核酸適配體篩選的工作,并對(duì)篩選得到的核酸適配體進(jìn)行優(yōu)化,主要內(nèi)容如下:
   (1)基于cell-SELEX技術(shù)篩選人膽管癌細(xì)胞株QBC-939核酸適配體
   基于cell-SELEX技術(shù),選擇人膽管癌細(xì)胞株QBC-9

3、39為靶細(xì)胞,人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721為對(duì)照細(xì)胞,優(yōu)化了篩選條件,通過(guò)逐漸增加篩選的壓力(如增加文庫(kù)與靶標(biāo)的比例、減少孵育時(shí)間、增加洗滌強(qiáng)度、增加反篩強(qiáng)度),經(jīng)過(guò)14輪的反復(fù)篩選,對(duì)收集的文庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明與人膽管癌細(xì)胞株QBC-939特異性結(jié)合的文庫(kù)得到了高度富集,最終選取第13輪富集產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序。
   (2)核酸適配體優(yōu)化以及不同核酸適配體對(duì)細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)的考察
   利用Clustal X2軟件模

4、擬通過(guò)篩選克隆已經(jīng)得到的核酸適配體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu),并根據(jù)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性進(jìn)行歸納分類(lèi),共得到六大類(lèi)不同結(jié)構(gòu)的序列。分別選取六大類(lèi)序列中的某一序列與細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析,結(jié)果獲得兩條解離常數(shù)均在納摩爾級(jí)別且與人膽管癌細(xì)胞株QBC-939能特異性結(jié)合的核酸適配體。根據(jù)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異性和相似性對(duì)獲得的兩條核酸適配體進(jìn)行了序列優(yōu)化,優(yōu)化后獲得一條高親和力、高特異性的只有23nt的核酸適配體。最后,初步考察了溫度對(duì)核酸適配體的影響和核酸適配體

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