SELEX法篩選果蠅神經(jīng)特異性拼接因子Dxl6的配體.pdf

1、前體 mRNA 的選擇性剪接發(fā)生頻率很高，它在人類基因組中廣泛存在，是增加蛋白質(zhì)多樣性及基因表達(dá)復(fù)雜程度的主要原因。近來研究顯示，一些富含絲氨酸和精氨酸蛋白(SR 蛋白)對(duì)于剪接的順利完成有著至關(guān)重要的作用。SR 蛋白是具有幫助識(shí)別正確剪接位點(diǎn)并促進(jìn)剪接體的成熟的一類重要剪接因子，為組成性剪接所必需，在選擇性剪接中更起著不可替代的作用。 Dx16基因是 2000 年克隆的一種新基因。根據(jù)氨基酸序列和核酸序列推測(cè)它可能是剪接因

2、子的候選基因。原位雜交顯示，Dx16基因主要在后期胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)。誘變劑 EMS (甲基磺酸乙酯)所致 Dx16 的 2 核甘酸缺失突變導(dǎo)致果蠅胚胎后期或 1 齡幼蟲致死。P 因子插入突變(插入內(nèi)含子區(qū)域)引起三齡幼蟲或后期蛹致死，但約有5﹪的逃逸者，這些逃逸者發(fā)育延遲并發(fā)有剛毛、翅膀、眼睛、腿等器官的發(fā)育異常。為了深入研究Dx16蛋白的功能，了解其在果蠅胚胎和胚胎后期及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用，本文用SELEX方法篩選

3、到了 Dx16 可能的作用靶序列。 首先，將Dx16氨基端含兩個(gè) RNA 識(shí)別基序的基因片段構(gòu)建入原核表達(dá)載體，通過摸索各種條件，成功地以可溶的形式表達(dá)了融合蛋白，并用 GST 親合層析柱進(jìn)行了純化，給后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了較好的工具。 其次，經(jīng)分離純化的Dx16N-GST 融合蛋白與RNA文庫(kù)在一定條件下孵育結(jié)合，共進(jìn)行六輪 SEIEX 篩選，得到了Dx16可能作用的靶序列，并用 EMSA 驗(yàn)證了它們之間的相互作用。