基于GFP的FRET監(jiān)測(cè)樹(shù)突棘鈣動(dòng)力學(xué).pdf

1、細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為傳遞信息的第二信使，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)分化起著重要作用。神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、細(xì)胞間信息傳遞、樹(shù)突的生長(zhǎng)、樹(shù)突棘的形成及突觸可塑性等都與細(xì)胞內(nèi)鈣離子有著密不可分的關(guān)系。研究表明，樹(shù)突棘內(nèi)的鈣離子參與調(diào)控多種信號(hào)途徑，并且對(duì)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）和長(zhǎng)時(shí)程抑制（LTD）有著重要貢獻(xiàn)，而LTP和LTD目前被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)。因此監(jiān)測(cè)海馬神經(jīng)元單個(gè)樹(shù)突棘的鈣濃度變化是研究突觸可塑性分子和細(xì)胞機(jī)制的關(guān)鍵。激光共聚焦顯微鏡

2、和鈣離子熒光探針的發(fā)展實(shí)現(xiàn)了生理狀態(tài)下樹(shù)突棘內(nèi)鈣信號(hào)的檢測(cè)。激光掃描共聚焦顯微鏡具有散射背景小、色差小、分辨率高等優(yōu)勢(shì)?；蛱结樖莾?nèi)源性大分子對(duì)細(xì)胞鈣動(dòng)力學(xué)影響小，同時(shí)，采用Ratio成像可以定量探測(cè)鈣離子濃度。本實(shí)驗(yàn)使用基于GFP的鈣離子基因探針——Cameleon來(lái)研究了樹(shù)突棘的鈣動(dòng)力學(xué)。首先，優(yōu)化了細(xì)胞培養(yǎng)、磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法，使用458nm激光代替430nm激光來(lái)進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）探測(cè)。然后，比較了不同Cameleon

3、的動(dòng)態(tài)范圍，458nm激發(fā)時(shí)YC2.1、YC6.1和YC3.60FRET比值的變化范圍分別為：33﹪，70﹪，220﹪。最后，初步完善了FRET定量鈣濃度的方法，應(yīng)用于：（1）靜息狀態(tài)下的鈣分布。在靜息狀態(tài)下，海馬神經(jīng)元的胞體、一級(jí)樹(shù)突、二級(jí)樹(shù)突、三級(jí)樹(shù)突和樹(shù)突棘內(nèi)鈣離子濃度分別為：104±22nM，71±10nM，55±6nM，40±7nM，56±14nM，樹(shù)突棘的鈣離子濃度高于對(duì)應(yīng)的樹(shù)突證實(shí)了樹(shù)突頸擴(kuò)散屏障的功能；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，靜息狀態(tài)

4、下樹(shù)突棘內(nèi)鈣離子濃度分布范圍13~80nM，這種鈣離子濃度的差異可能與樹(shù)突棘的成熟度、功能以及鈣運(yùn)作方式等有關(guān)。（2）生理刺激對(duì)胞體和樹(shù)突棘內(nèi)鈣離子濃度的影響。吹加谷氨酸來(lái)研究了神經(jīng)元的胞體和樹(shù)突棘的鈣動(dòng)力學(xué)，在100μM的谷氨酸的刺激下胞體內(nèi)鈣離子濃度從100nM上升到1μM左右，而樹(shù)突棘內(nèi)鈣離子濃度從50nM上升達(dá)到500nM。結(jié)果表明，利用Cameleon的FRET比值變化來(lái)定量監(jiān)測(cè)樹(shù)突棘鈣動(dòng)力學(xué)的方法是切實(shí)可行的，并可以進(jìn)行實(shí)時(shí)