幾類金屬酶和糖苷酶催化機理的理論研究.pdf

1、酶是一切生命活動的基礎，幾乎所有細胞內的代謝反應都離不開酶的參與。正是由于酶的催化作用，生物代謝活動中產(chǎn)生的物質和能量才能滿足生物體的需求。由于酶具有傳統(tǒng)催化劑難以與之媲美的高效性和專一性以及催化反應類型的多樣性，越來越多的酶已經(jīng)應用到環(huán)境、藥物、工業(yè)等領域，可以預計未來會有更多的仿生催化劑和工程酶應用到工業(yè)生產(chǎn)中。對酶的活性以及特異性機制的充分認識不僅是了解生命活動規(guī)律的基礎，也是對酶進行修飾改造的前提。但由于酶結構和反應機理的復雜性

2、，僅靠實驗方法難以對酶催化反應機理進行全面系統(tǒng)的了解。通過理論與計算化學方法可以從原子水平上揭示酶催化反應的機理，對實驗上難以觀測到的過渡態(tài)及中間體結構進行研究。目前，酶催化反應的理論計算研究是酶催化領域的研究熱點之一。
　　理論計算化學方法有很多，研究中需要依據(jù)要解決的問題選擇合適的方法。本論文主要利用量子力學和分子力學相結合的QM/MM方法對幾類金屬酶和糖苷酶的催化反應機理進行了較為系統(tǒng)的研究，確定了酶催化反應的最可能路徑，得

3、到了反應中間體及過渡態(tài)的結構和能量學信息，明確了酶活性中心殘基在催化過程中所起的作用，計算結果揭示了這些酶催化反應的機制，對相關實驗現(xiàn)象做出解釋，并能與現(xiàn)有的一些實驗結果很好地吻合，同時也對實驗結果做了進一步的說明和補充，對相關酶反應機理的理解解及酶應用奠定了必要的理論基礎。
　　主要研究工作如下:
　　(1)AsqJ加雙氧酶催化喹啉生物堿合成機理的理論研究
　　喹諾酮結構是多種生物活性分子的骨架結構，4'-甲氧基綠霉

4、素中的4-芳基喹啉片段存在于多種喹啉、喹諾酮生物堿中。近期研究表明曲霉屬真菌中的AsqJ酶在4′-甲氧基綠霉素的生物合成中起重要作用，并且AsqJ酶屬于非血紅素FeⅡ/酮戊二酸依賴加雙氧酶。2016年有人報道了AsqJ與底物結合的晶體結構，并通過實驗證實AsqJ酶通過催化兩個非耦合的去飽和化與環(huán)氧化反應將底物轉化為4’-甲氧基綠霉素?；诘玫降木w結構，本文采用QM/MM方法對AsqJ催化的去飽和化反應與環(huán)氧化反應進行了研究。計算結果表

5、明，F(xiàn)eⅣ-O復合物需通過一個異構化過程來引發(fā)整個催化反應，在去飽和化過程中，F(xiàn)eⅣ=O復合物奪取第一個氫的反應是通過σ-通道進行的，且該反應是催化反應的決速步驟，對應的能壘為19.3 kcal/mol。在環(huán)氧化過程中，再次生成的FeⅣ=O復合物對去飽和化中間體的C=C進行加氧反應，對應的能壘為18.1 kcal/mol。此外，基于底物N4位缺少甲基會導致催化反應不能進行的實驗事實，本文還考察了N4-甲基對反應的影響，計算發(fā)現(xiàn)，N4-甲

6、基的缺失并未直接影響FeⅣ=O的奪氫反應，可能是通過影響酮戊二酸的氧化反應而對催化反應產(chǎn)生影響。這些結果對進一步理解非血紅素加雙氧酶的反應機理以及喹啉生物堿的生物合成路徑提供了堅實的理論基礎。
　　(2)咪唑啉酮酸酶催化機理的理論研究
　　組氨酸在生物體內的降解受到嚴格控制，自然界中組氨酸的降解路徑從原核生物到真核生物都是高度保守的。咪唑啉酮酸酶(HutI，EC3.5.2.7)是生物體中組氨酸降解路徑中的第三種酶，該酶催化4

7、-咪唑啉酮-5-丙酸(IPA)水解生成L-谷氨酸。前人依據(jù)實驗結果建議了大致的反應機理，但關于該酶的底物選擇性、水分子活化機制等問題依然沒有得到解決。本文使用QM/MM方法對IPA的(S)-和(R)-對映體的同分異構體sIPA-1，SIPA-2，RIPA-1和RIPA-2的催化反應進行了研究。計算結果表明，起水解作用的水分子（與鋅配位的水分子）是E252殘基通過橋連水分子來活化的，且發(fā)生在與底物與酶結合之前。在底物結合之后，活化通道就會

8、被底物阻斷;另外兩個殘基(D324，H272)不能活化水分子。HutI只能將IPA的兩個(S)-對映體中的sIPA-1轉換成L-谷氨酸，其能量勢壘為16.6kcal mol-1。而SIPA-2的轉換能壘則為21.9 kcal mol-1。然而，對于兩個(R)-對映體來說，RIPA-1能壘更高一些(21.8 kcal mol-1)，RIPA-2在活性位點的結合作用比sIPA-2更弱?；谟嬎憬Y果，sIPA-1是HutI最佳的底物，而sIP

9、A-2的水解斷鍵可能需要先轉化為sIPA-1才能發(fā)生。通過計算我們給出了HutI催化反應的細節(jié)，明確了HutI酶的底物選擇性，為深入了解L-組氨酸在哺乳動物和細菌中的生物降解路徑提供了理論基礎。
　　(3)氮-乙酰葡糖胺糖苷水解酶催化機理的理論研究
　　糖類在生物體內有許多重要的作用，它除了可以作為結構組分以及提供生物體必要的能量外，還通過對肽聚糖的修飾在免疫響應中扮演重要的角色。肽聚糖(PG)的代謝路徑對于細菌的生長至關重

10、要。β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶(NagZ)是肽聚糖代謝路徑中一種重要蛋白酶。依據(jù)氨基酸順序以及二級結構的分類，NagZ酶屬于糖苷水解酶第三家族(GH3)。然而，最近的實驗研究發(fā)現(xiàn)NagZ酶...是糖苷磷酸化酶而不是糖苷水解酶。為進一步從原子水平上探究NagZ酶的催化機理，本文用QM/MM方法對來源于枯草芽孢桿菌的NagZ酶（BsNagZ）的催化反應進行了研究。計算結果表明，整個催化循環(huán)的決速步是糖基化反應，該結論與實驗研究相符。糖基化反應

11、對應的能壘為19.3 kcal/mol，該能壘與實驗上通過使用類似底物進行反應動力學實驗預測的自由能能壘(16.4 kcal/mol)近似。對于去糖基化過程，對水解機理和磷酸化機理的對比研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化對應的能壘為(1.8 kcal/mol)，較水解路徑的能壘低(17.7 kcal/mol)，這一結果支持了之前關于NagZ酶為磷酸化糖苷酶的結論。研究還發(fā)現(xiàn)，不論是在糖基化還是去糖基化過程中都有類似于羰基正離子過渡態(tài)的參與，活性中心底物的

12、構型變化對反應有較大影響，以上理論計算與實驗預測吻合。這些計算結果有助于深入理解NagZ酶的催化機理，有助于針對GH3家族β-1，4葡糖胺苷酶的抑制劑的研發(fā)。
　　(4)α-1，4-糖苷裂解酶催化機理的理論研究
　　α-1，4-糖苷裂解酶(GLases，EC4.2.2.13)是糖苷水解酶家族中獨特的一員，它可以特異性的催化糖原、淀粉以及低聚麥芽糖中α-1，4-糖苷鍵的斷裂，從多糖的非還原端斷開糖苷鍵生成1，5-脫水-D-果糖

13、。之前的研究表明，GLases屬于構型保持型糖苷裂解酶，在催化反應中涉及到糖苷酶中間體的形成，整個催化循環(huán)包括羰基化和去糖基化/消除兩個過程?；谧钚掳l(fā)表的晶體結構(2X2I)，本文用QM/MM方法對GLases進行了研究。結果表明，整個催化循環(huán)包含五步基元反應。首先天冬氨酸D665做為路易斯酸，向糖苷氧提供一個質子，同時糖苷鍵發(fā)生斷裂。然后去質子化的D553殘基進攻端基碳形成糖苷酶中間體，該中間體的存在在實驗上已得到了論證。在此糖基化

14、過程中普通的保持型糖苷酶是通過協(xié)同機理進行的，而該酶的糖基化過程是分步進行的。對于去糖基化/消除反應，我們考慮了反應是在麥芽三糖離開活性位點前發(fā)生的或在麥芽三糖離開活性位點之后發(fā)生的兩種情況。計算結果表明，麥芽三糖的離去有利于去糖基化/消除反應的進行，在這步反應中，去質子化的D553殘基可以作為催化堿來奪取糖環(huán)上C2位置的質子，并且去糖基化/消除反應中的奪質子反應是整個催化反應的決速步，兩種情況對應的勢壘分別是20.59和18.53 k

15、cal/mol。糖苷化過程通過D665殘基對糖苷氧的質子化來引發(fā)反應，糖苷裂解酶的糖基化過程是通過分步反應機理發(fā)生的，并且去糖基化/消除反應是整個催化循環(huán)的決速步，這些研究結果對于理解α-1，4糖苷酶的催化機理提供了理論依據(jù)，并對該類酶的工業(yè)應用提供了理論基礎。
　　本論文特色和創(chuàng)新之處
　　弄清酶催化反應的機理不僅有助于理解這些蛋白酶的生物學功能，也是對這一高效生物催化劑進行工業(yè)應用的重要前提。本論文采用理論化學方法對兩類

16、金屬酶（AsqJ加雙氧酶、咪唑啉酮酸酶）以及兩類糖苷酶(BsNagZ酶、α-1，4糖苷裂解酶)的催化反應進行了系統(tǒng)深入的研究，取得了以下重要成果:
　　(1)系統(tǒng)地闡明了AsqJ加雙氧酶催化合成喹啉生物堿的機制，確定了在AsqJ的催化反應中FeⅣ-O的異構化是催化反應的必需步驟，F(xiàn)eⅣ-O復合物的奪氫反應遵循σ-通道機理，分步進行的環(huán)氧化反應和去飽和化過程都經(jīng)歷碳自由基中間體，對AsqJ不能催化N4-位不含有甲基的底物類似物的本質

17、原因進行了探討。
　　(2)預測了咪唑啉酮酸酶(HutI)對四種4-咪唑啉酮-5-丙酸(IPA)的同分異構體的催化活性，闡明了HutI對底物的選擇性本質，解決了實驗上存在爭議的水分子水分子的活化機制問題，明確了反應中鋅離子的作用。
　　(3)從理論闡明了β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶(NagZ)酶屬于磷酸化酶而不是水解酶，即去糖基化過程遵循磷酸化機理，不論是糖基化還是去糖基化過程中都經(jīng)過類似于羰基正離子過渡態(tài)，明確了對該酶底物扭曲