幾類(lèi)含鐵酶和糖相關(guān)酶催化反應(yīng)機(jī)理的理論研究.pdf

1、本論文主要使用量子力學(xué)與分子力學(xué)組合(QM/MM)的方法系統(tǒng)地探討幾類(lèi)重要的含鐵酶和糖相關(guān)酶的催化反應(yīng)機(jī)理。通過(guò)理論研究深入探討了酶與底物的作用機(jī)制和酶催化反應(yīng)的詳細(xì)歷程，確定了催化反應(yīng)的最優(yōu)路徑、反應(yīng)過(guò)程中涉及到的過(guò)渡態(tài)和中間體的結(jié)構(gòu)以及相關(guān)的能量學(xué)信息，明確了酶活性中心一些關(guān)鍵殘基的重要作用。研究結(jié)果不僅能夠與現(xiàn)有的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好地吻合，還對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做了進(jìn)一步的補(bǔ)充。這些理論研究對(duì)實(shí)驗(yàn)上探討相關(guān)酶的催化機(jī)理及實(shí)際應(yīng)用都有一定的指導(dǎo)

2、意義。
　　本論文的主要研究工作如下:
　　(1)碳青霉烯合成酶(CarC)催化機(jī)理的理論研究
　　碳青霉烯是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的一個(gè)重要分支，與其它β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素相比，碳青霉烯類(lèi)的抗菌譜更廣，抗菌活性更強(qiáng)，且對(duì)β-內(nèi)酰胺酶表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。然而，近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明細(xì)菌對(duì)碳青霉烯的抗藥性正在增加。因此，深入研究碳青霉烯的生物合成機(jī)制對(duì)制藥工程上設(shè)計(jì)新的碳青霉烯變體以抵抗細(xì)菌的抗藥性顯得尤為重要。簡(jiǎn)單的天然碳

3、青霉烯-3-羧酸的生物合成只需要三種酶，其中一種是碳青霉烯合成酶（CarC）。CarC屬于FeⅡ和2-羰基酮戊二酸依賴(lài)的氧化酶家族，在碳青霉烯生物合成路徑中，CarC催化(3S,5S)-碳青霉烷發(fā)生C5-差向異構(gòu)化和C2/3-去飽和化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成(5R)-碳青霉烯?；谠缙贑lifton等人報(bào)道的晶體結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)和理論計(jì)算都對(duì)差向異構(gòu)化和去飽和化機(jī)理進(jìn)行了研究。但是考慮到這個(gè)晶體結(jié)構(gòu)是不完整的，其中缺失了活性位點(diǎn)附近的兩部分關(guān)鍵loop區(qū)，

4、先前建議的反應(yīng)機(jī)理的合理性值得懷疑。最近，實(shí)驗(yàn)上報(bào)道了CarC的完整晶體結(jié)構(gòu)，使得我們可以通過(guò)QM/MM計(jì)算探討其詳細(xì)的催化機(jī)理。我們首先分析了O2在金屬上的結(jié)合位點(diǎn)，并識(shí)別出FeⅣ=O有兩種潛在的朝向:其氧基正對(duì)著His101或者正對(duì)著His251。前者能量上很不穩(wěn)定且不能與底物反應(yīng)，但是它可以通過(guò)氧基的旋轉(zhuǎn)快速異構(gòu)化成后者。殘基Arg67在調(diào)控雙氧結(jié)合和協(xié)助FeⅣ=O異構(gòu)化方面起著重要作用。與早期理論計(jì)算建議的耦合的差向異構(gòu)化和去飽

5、和化反應(yīng)不同，QM/MM計(jì)算結(jié)果明確支持分步的差向異構(gòu)化和去飽和化反應(yīng)，整個(gè)催化反應(yīng)需要兩個(gè)完整的氧化循環(huán)。在差向異構(gòu)化反應(yīng)中，CarC催化(3S,5S)-碳青霉烷轉(zhuǎn)化成初始產(chǎn)物(3S,5R)-碳青霉烷，反應(yīng)涉及到H5原子奪取、C5-自由基的翻轉(zhuǎn)和反向C5-H鍵的重建。在去飽和化反應(yīng)中，(3S,5R)-碳青霉烷以一個(gè)新的朝向重新結(jié)合進(jìn)CarC的活性位點(diǎn)。C2-C3去飽和化反應(yīng)中除了FeⅣ=O沒(méi)有涉及到任何活性位點(diǎn)殘基。計(jì)算結(jié)果表明與(3

6、S,5S)-碳青霉烷相比，(3S,5R)-碳青霉烷中間體更適合作為CarC的底物。在CarC的作用下，(3S,5R)-碳青霉烷中間體可以通過(guò)高效的去飽和化反應(yīng)直接轉(zhuǎn)化成最終產(chǎn)物（5R)-碳青霉烯。此外，在CarC催化反應(yīng)中，底物羥基化一直與目標(biāo)異構(gòu)化和去飽和化反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)。我們的研究提供了詳細(xì)合理的CarC催化機(jī)理，這對(duì)碳青霉烯抗生素的生物合成工程有一定的指導(dǎo)意義。
　　(2)工程細(xì)胞色素P450BM3酶催化機(jī)理的理論研究
　　

7、典型的P450酶通常催化O2參與的C/N-H鍵活化、烯烴環(huán)氧化、醛/酮烯化反應(yīng)等。與酶催化的烯烴環(huán)氧化反應(yīng)類(lèi)似，有機(jī)合成上經(jīng)常通過(guò)把等電子的卡賓轉(zhuǎn)移給烯烴來(lái)得到新的環(huán)丙烷產(chǎn)物，但是這種反應(yīng)在生物體內(nèi)幾乎不可能發(fā)生。受P450酶催化的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性的啟發(fā)，Arnold課題組于2013年首次報(bào)道了P450BM3酶的工程變體催化烯烴的環(huán)丙烷化反應(yīng)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)工程P450酶還能催化C-H胺化反應(yīng)、硫亞胺化反應(yīng)、氮雜環(huán)丙烷化反應(yīng)等。

8、這些研究不僅豐富了P450酶的應(yīng)用價(jià)值，也對(duì)實(shí)驗(yàn)上設(shè)計(jì)其他的一些新酶催化合成更多的自然界不常見(jiàn)的反應(yīng)提供了一個(gè)堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。遺憾的是，到目前為止工程酶催化反應(yīng)機(jī)理的理論研究依然鮮有報(bào)道。以工程P450BM3酶催化的烯烴環(huán)丙烷化反應(yīng)為例，盡管實(shí)驗(yàn)上通過(guò)設(shè)計(jì)一些P450變體并使用不同的疊氮酯試劑和烯烴，已經(jīng)充分證明了這種反應(yīng)的可行性和可調(diào)性，但是并沒(méi)有從微觀水平上對(duì)環(huán)丙烷化反應(yīng)機(jī)理以及反應(yīng)的立體選擇性進(jìn)行更深層次的探索。在本章中，我們應(yīng)用QM

9、和QM/MM方法詳細(xì)研究了工程P450BM3酶催化的苯乙烯環(huán)丙烷化機(jī)理以及反應(yīng)的立體選擇性。QM計(jì)算結(jié)果表明不管Fe-卟啉卡賓的軸向配體是巰基還是羥基，其基態(tài)都是三重自旋態(tài)，這也與QM/MM計(jì)算結(jié)果一致。Fe-卟啉卡賓是一個(gè)高活性的中間體，在三重態(tài)勢(shì)能面上Fe-卟啉卡賓很容易與苯乙烯的末端烯基反應(yīng)生成一個(gè)C-自由基中間體，隨后C-自由基進(jìn)攻Fe-C鍵上的C原子得到最終的環(huán)丙烷化產(chǎn)物。反應(yīng)的立體選擇性只取決于疊氮酯試劑和苯乙烯在工程P45

10、0BM3酶活性中心的相對(duì)朝向，而不能僅僅從某一種固定的相對(duì)朝向出發(fā)通過(guò)在反應(yīng)中旋轉(zhuǎn)苯基或者酯基來(lái)實(shí)現(xiàn)。QM/MM計(jì)算進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，把工程P450BM3-CIS酶中Fe的軸向半胱氨酸配體突變成絲氨酸在一定程度上有利于cis產(chǎn)物的形成，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。這些理論研究揭示了工程P450BM3酶催化的立體選擇性的本質(zhì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)上設(shè)計(jì)新的P450酶變體以提高反應(yīng)的立體選擇性具有重要的指導(dǎo)意義。
　　(3)尿苷二磷酸連接糖氮-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(W

11、lbB)催化機(jī)理的理論研究
　　氮-乙?；D(zhuǎn)移酶(NAT)是最大的超酶家族之一，它能催化乙?；o酶A(acetyl-CoA)轉(zhuǎn)移其乙酰基到各式各樣的受體底物的氨基上。研究證實(shí)NAT參與很多的生理活動(dòng)，例如:人體中致癌物的活化和解毒、細(xì)菌中氨基甙抗生素的滅活、組蛋白修飾以及脊椎動(dòng)物的睡眠-覺(jué)醒周期等。ManNAc3NAcA是一種不常見(jiàn)的雙氮-乙酰基化的脫氧糖，廣泛存在于一些革蘭氏陰性病菌的外膜中，其前驅(qū)體是UDP-ManNAc3NA

12、cA，通常由五種酶聯(lián)合催化合成得到。第四種酶在Bordetella pertussis中也稱(chēng)作WlbB，是一種氮-乙酰基轉(zhuǎn)移酶，它催化尿苷二磷酸-2-乙酰氨基-3-氨基-2,3-二脫氧-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcNAc3NA)轉(zhuǎn)變成尿苷二磷酸-2,3-二乙酰氨基-2,3-二脫氧-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcNAe3NAcA)。本文使用QM/MM方法探討了WlbB催化的乙?；瘷C(jī)理。乙酰基化反應(yīng)是在底物的協(xié)助下完成的，沒(méi)有任何活性位

13、點(diǎn)殘基直接參與。與實(shí)驗(yàn)上建議的氧負(fù)離子四面體中間體不同，通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)反應(yīng)會(huì)經(jīng)歷一個(gè)帶負(fù)電荷的CoA和一個(gè)帶正電荷的中間體。盡管殘基Asn84沒(méi)有直接參與酶催化反應(yīng)，但是其在合理定位底物氨基上的孤電子對(duì)朝向及穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)和中間體方面起著重要作用。此外，理論研究還發(fā)現(xiàn)一個(gè)合理的初始酶-底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)對(duì)準(zhǔn)確探討酶催化機(jī)理并獲得合理的能量關(guān)系至關(guān)重要。
　　(4)脫氧胸苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脫水酶(DesⅣ)催化機(jī)理的理論研究
　

14、　脫氧糖是一類(lèi)重要的碳水化合物，廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞表面的糖蛋白、脂多糖和糖脂中，也存在于很多微生物二級(jí)代謝產(chǎn)物中。D-脫氧糖胺就是一種典型的脫氧糖，它不僅參與很多的生命活動(dòng)，還是一些大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素如酒霉素、嘌呤霉素和紅霉素等的重要組成部分。臨床研究表明在大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素中如果存在脫氧糖，它們的生物活性會(huì)明顯增強(qiáng)。相反，如果從這些藥物中移除脫氧糖，它們的藥理特性會(huì)被減弱甚至被消除。脫氧胸苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脫水酶(DesⅣ)是D-

15、脫氧糖胺生物合成路徑中必需的一種酶，它催化脫氧胸苷二磷酸-葡萄糖(dTDP-glucose)轉(zhuǎn)化成脫氧胸苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖（dTDP-4-keto-6-deoxy-glucose）。
　　(5)尿苷二磷酸-氮-乙酰葡糖胺-5,6-脫水酶(TunA)催化機(jī)理的理論研究
　　尿苷二磷酸-氮-乙酰葡糖胺-5,6-脫水酶(TunA)是短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)家族的一個(gè)特殊成員，它催化尿苷二磷酸-氮-乙酰葡糖胺(UD

16、P-GlcNAc)轉(zhuǎn)化成尿苷二磷酸-4-酮基-氮-乙酰葡糖胺-5,6-烯（UDP-4-keto-GlcNAc-5,6-ene）。TunA是衣霉素生物合成路徑中必需的一種酶。衣霉素是一種重要的?；塑疹?lèi)抗生素，它能夠抑制具有包膜的病毒的繁殖，是醫(yī)學(xué)上常用的抗生素之一。本文通過(guò)QM/MM計(jì)算詳細(xì)探討了TunA的催化機(jī)理。與DesⅣ類(lèi)似，TunA催化反應(yīng)也可劃分成氧化、脫水和還原三個(gè)連續(xù)的化學(xué)步驟。氧化步是一個(gè)吸熱反應(yīng)，能壘是21.6 kca

17、l/mol,并且它以一個(gè)協(xié)同異步的機(jī)理進(jìn)行。脫水反應(yīng)以E1cB機(jī)理進(jìn)行，包含質(zhì)子轉(zhuǎn)移和羥基消除兩步。殘基Glu121先作為一個(gè)廣義堿然后再作為酸參與水的消除反應(yīng)，而Cys120雖然沒(méi)有直接參與反應(yīng)，但是它在維持活性位點(diǎn)排布方面起著重要作用。還原步是氧化反應(yīng)的逆反應(yīng)，也是以協(xié)同異步機(jī)理進(jìn)行，只不過(guò)氫負(fù)離子轉(zhuǎn)移先于質(zhì)子轉(zhuǎn)移發(fā)生。通過(guò)理論計(jì)算我們修訂了先前實(shí)驗(yàn)上建議的TunA的催化機(jī)理，這能為其它SDR家族成員的催化機(jī)理研究提供一定的理論指導(dǎo)

18、。
　　(6)果膠酸裂解酶(BsPel)催化機(jī)理的理論研究
　　膠質(zhì)不僅是植物細(xì)胞壁的重要組成部分，參與很多的生化過(guò)程，還是食品工業(yè)上廣泛使用的增稠劑和穩(wěn)定劑。在植物軟腐爛過(guò)程中，果膠酸裂解酶是解聚膠質(zhì)必不可少的一種酶，其催化聚半乳糖的α-1,4糖苷鍵裂解，產(chǎn)生4,5-不飽和的寡半乳糖。雖然實(shí)驗(yàn)上已經(jīng)對(duì)很多植物致病菌中的果膠酸裂解酶的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了大量的研究并取得了很多重要進(jìn)展，但到目前為止還沒(méi)有對(duì)其催化應(yīng)機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)的理