FDR3和FDR4的細(xì)胞定位和功能鑒定.pdf

1、fdr(Fe-deficiency-related)是從缺鐵誘導(dǎo)的玉米根cDNA文庫中篩選得到的cDNA克隆，其全長為3.3kb。經(jīng)過對fdr基因進(jìn)行廣泛的同源性比較，至今沒有發(fā)現(xiàn)任何同源性序列，經(jīng)ORFFinder分析發(fā)現(xiàn)其包含有兩個(gè)大小分別為1068bp和648bp的開放閱讀框，分別命名為fdr3和fdr4。前人已經(jīng)將fdr3和fdr4構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBI121上，并將標(biāo)記基因his6-c-mycepitope構(gòu)建到fdr3和f

2、dr4之前，形成了帶有標(biāo)記基因的植物融合表達(dá)載體T-DNA-his6-c-myc：：fdr3(簡寫為Fdr3)及T-DNA-his6-c-myc：：fdr4(簡寫為Fdr4)。 本人將植物融合表達(dá)載體Fdr3和Fdr4轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105中，再通過葉盤法轉(zhuǎn)化野生型煙草SRI。通過多次繼代，得到具有Kan抗性的植株。利用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(PCR-Southern，RT-PCR，分子雜交技術(shù)等)對植株進(jìn)行鑒定，然后將轉(zhuǎn)基因陽性

3、植株植入營養(yǎng)土中培養(yǎng)，收取T1代種子。對T1代煙草進(jìn)行分子水平鑒定，將鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草進(jìn)行四種鐵營養(yǎng)的水培處理，對比轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在不同鐵營養(yǎng)條件下的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)它們在葉片形態(tài)、根系形態(tài)和根的長短粗細(xì)等方面無明顯區(qū)別，只是在葉片的綠色程度上有顯著差別，表明葉片中葉綠素的含量不同。以轉(zhuǎn)基因植株為材料，對植株葉片進(jìn)行亞顯微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)野生型煙草與轉(zhuǎn)基因煙草中的葉綠體、淀粉粒含量以及葉綠體中的基粒片層結(jié)

4、構(gòu)明顯不同。以熒光免疫細(xì)胞化學(xué)方法分析基因的細(xì)胞定位，結(jié)果表明兩個(gè)基因都定位在葉綠體上。通過生物信息學(xué)預(yù)測到：FDR3蛋白可能定位在葉綠體類囊體區(qū)；FDR4蛋白可能定位在膜上；FDR3蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，也沒有信號肽，是一種可溶性蛋白，它與Ⅲ型分泌系統(tǒng)中FliN蛋白有相似的結(jié)構(gòu)域；FDR4蛋白有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，并有信號肽，屬分泌性蛋白，它與Ⅲ型分泌系統(tǒng)中Flip蛋白有相似的結(jié)構(gòu)域；它們都含有一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。