水稻端粒酶RNA模板基因候選序列的克隆與鑒定.pdf

1、水稻是植物轉(zhuǎn)基因中研究較早的模式生物，以其為模型進行的遺傳學研究不勝枚舉。端粒和端粒酶的研究也已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學、遺傳學的焦點，不斷有研究表明端粒的長度、端粒酶的活性與人的疾病和衰老、干細胞和器官再生有著密切的關(guān)聯(lián)，尤其是端粒酶活性對于癌癥診斷的表征具有重要的指導意義。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，關(guān)于端粒和端粒酶的研究多集中在動物方向，而植物中的研究較少，只有擬南芥的端粒酶RNA模板相關(guān)的TER基因有所報道，該研究在植物中是否具有普遍性還有待進一步驗證。由

2、于植物在人工組織培養(yǎng)環(huán)境下可直接進入“永生化”，且容易獲得端粒酶活性較高的組織材料，在端粒和端粒酶研究中具有極大優(yōu)勢。因而，以水稻作為端粒和端粒酶研究的突破點占據(jù)了極大的便利，也具有重要的意義。
　　 本研究旨在建立一套簡單易行的水稻端粒酶RNA模板基因候選序列鑒定體系。研究以水稻全基因組為模板，擴增出了水稻端粒酶RNA模板基因候選序列，并借助重疊PCR方法對模板基因序列進行定點突變，擴增得到的野生型序列和突變型序列分別裝載到p

3、MD18-T載體中測序鑒定。測序正確的樣品經(jīng)雙酶切分別裝載到pCambial301載體中并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404細胞，完成了pCambial301-T突變型、pCambial301-Y野生型穿梭載體的構(gòu)建。經(jīng)農(nóng)桿菌介導，選用不同水稻品種和組織，探索端粒酶RNA模板基因候選序列的鑒定體系。結(jié)果顯示，用不同水稻品種誘導愈傷組織，差異顯著。其中，中花11號可快速誘導出愈傷組織，比廣陸矮4誘導時間縮短一半，用成熟胚和幼胚分別誘導愈傷組織，則基

4、本無差異。
　　 利用水稻端粒酶對端粒序列的合成作用，根據(jù)水稻不同染色體上的端粒特征設(shè)計8對端粒特異引物分別對突變型、野生型、正常愈傷組織進行基因組DNA端粒鑒定。結(jié)果表明，引物04q作為上游引物時檢測到突變型端粒酶活性高于兩個對照組，并且退火溫度為60℃時突變型端粒酶活性顯著高于野生型和正常反應(yīng)的端粒酶活性，一定意義上表明待測的水稻端粒酶RNA模板基因?qū)τ谒镜亩肆Ｃ富盍S持具有重要意義。此外，對三組樣本進行的端粒酶活性分析也