產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌的耐藥性及相關(guān)耐藥機(jī)制.pdf

1、目的： 了解安徽省產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況，揭示其相關(guān)耐藥機(jī)制，指導(dǎo)臨床合理用藥。 研究新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的分子生物學(xué)特性。 材料與方法： 安徽省細(xì)菌耐藥性監(jiān)控中心收集2005年隨機(jī)月份35所醫(yī)院住院和門(mén)診患者的各種臨床送檢標(biāo)本，無(wú)重復(fù)分離的大腸埃希菌共402株。采用MH瓊脂倍比稀釋法對(duì)野生菌進(jìn)行12種抗菌藥物的藥物敏感試驗(yàn)。 經(jīng)頭孢西丁表型試驗(yàn)進(jìn)行初步篩選，對(duì)初

2、篩陽(yáng)性及可疑陽(yáng)性的細(xì)菌，采用三維試驗(yàn)篩選高產(chǎn)AmpC酶株。對(duì)所有菌株通過(guò)多重PCR擴(kuò)增質(zhì)粒介導(dǎo)ampC基因。對(duì)產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶菌株用PCR方法檢測(cè)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因、l類整合子基因盒插入序列和主動(dòng)外排系統(tǒng)acrAB-tolC基因，以揭示其是否存在多種耐藥機(jī)制。 將多重PCR陽(yáng)性的菌株行轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)，并行全編碼引物PCR擴(kuò)增。對(duì)多次測(cè)序并經(jīng)GenBank比對(duì)后確定的產(chǎn)新酶菌株進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：PCR擴(kuò)增野生株和/

3、或轉(zhuǎn)移接合子中的AmpC型β-內(nèi)酰胺酶編碼基因片段，克隆入pUC-118載體，表達(dá)于感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌JM109中，再次測(cè)定核苷酸序列，結(jié)果至GenBank比對(duì)，進(jìn)行DNA序列分析。 將新酶全編碼基因克隆入表達(dá)載體pHSG398，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌JM109中，用加有抗菌藥物的瓊脂平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化株篩選。用瓊脂倍比稀釋法對(duì)野生株、接合子與轉(zhuǎn)化株同時(shí)進(jìn)行MIC測(cè)定。 采用超聲破碎法進(jìn)行產(chǎn)新酶細(xì)菌轉(zhuǎn)化株的粗酶提取，等電

4、聚焦電泳測(cè)定其等電點(diǎn)(pI)。對(duì)粗酶純化后，SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色測(cè)定新酶分子量大小，進(jìn)行酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，以初步了解新酶的動(dòng)力學(xué)特性。 采用Southern Blotting試驗(yàn)再次驗(yàn)證新酶是否由質(zhì)粒介導(dǎo)并定位其編碼基因所在質(zhì)粒大小。 結(jié)果： 檢出產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶菌株28株(7.0％)。產(chǎn)酶菌株對(duì)12種常用抗菌藥物，除亞胺培南、美羅培南全部敏感外，對(duì)其他大多數(shù)抗菌藥物耐藥率均高于非產(chǎn)酶株。28株產(chǎn)

5、酶菌株中有23株表現(xiàn)為多重耐藥，20株檢測(cè)出各型ESBLs基因，21株擴(kuò)增出1類整合子基因盒插入序列，20株主動(dòng)外排系統(tǒng)acrAB-tolC基因陽(yáng)性。 對(duì)402株大腸埃希菌用多重PCR檢測(cè)質(zhì)粒介導(dǎo)ampC基因，有28株陽(yáng)性，再分別用單對(duì)引物對(duì)陽(yáng)性株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示：CIT陽(yáng)性11株，EBC陽(yáng)性7株，DHA陽(yáng)性7株，ACC陽(yáng)性2株，MOX陽(yáng)性1株。 對(duì)28株產(chǎn)酶菌PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)有兩株為

6、新的質(zhì)粒ampC基因型，其基因序列均已提交GenBank，獲得的登錄號(hào)分別為：EF054895，EF417572，其中一株所產(chǎn)新酶經(jīng)Jacoby GA同意并命名為MIR-4。 產(chǎn)新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶菌株的轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)和克隆表達(dá)試驗(yàn)均取得成功，其野生株、接合子及轉(zhuǎn)化株的MIC結(jié)果顯示：野生株和接合子有著幾乎相同的耐藥譜，而轉(zhuǎn)化株對(duì)部分藥物的敏感性較前兩者明顯下降。 產(chǎn)新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶細(xì)菌轉(zhuǎn)化株的等電聚焦及SDS-P

7、AGE結(jié)果顯示，其等電點(diǎn)在8.2左右，蛋白質(zhì)分子量約為35kDa。Southern Blotting試驗(yàn)再次證實(shí)了新酶由質(zhì)粒介導(dǎo)并定位其編碼基因位于54Kb的質(zhì)粒。 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，初步了解新酶對(duì)5種常用抗菌藥物的Km值和Vmax值，結(jié)果顯示：該酶對(duì)頭孢他啶的水解效率最低. 結(jié)論： 本地區(qū)產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率均較高，多重耐藥現(xiàn)象普遍，同時(shí)存在多種耐藥機(jī)制，其中以產(chǎn)生滅活酶和

8、1類整合子介導(dǎo)的耐藥機(jī)制為主。對(duì)產(chǎn)酶株臨床經(jīng)驗(yàn)用藥可選用碳青霉烯類、阿米卡星、四代頭孢菌素類抗菌藥物。 本地區(qū)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶以CIT，EBC，DHA型為主。經(jīng)對(duì)編碼基因比對(duì)分析后鑒定其中兩株為新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶，均是首次在安徽省被發(fā)現(xiàn)。產(chǎn)新酶菌株存在多種耐藥機(jī)制，且可通過(guò)質(zhì)粒在不同菌株之間傳遞，因此有必要加強(qiáng)本地區(qū)產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶菌株的監(jiān)測(cè)并同其他地區(qū)進(jìn)行耐藥資料的交換，以形成大的耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)，這些工作對(duì)于阻止耐藥基因