平滑肌收縮功能障礙通路上的基因多態(tài)性與主動(dòng)脈夾層發(fā)生和預(yù)后的相關(guān)性分析.pdf

1、主動(dòng)脈夾層(aortic dissection,AD)是主動(dòng)脈內(nèi)膜撕裂,循環(huán)中的血液通過裂口進(jìn)入主動(dòng)脈肌壁內(nèi),導(dǎo)致血管壁分層。目前知道主動(dòng)脈夾層通常與中層的結(jié)構(gòu)改變有關(guān),囊性中層壞死、纖維化、彈力纖維變脆,是本病特有的組織病理學(xué)改變。
　　 據(jù)國(guó)外報(bào)道,AD的發(fā)病率約為每年每百萬人中5～30例[1]。在急診中因胸背痛就診的患者中AD占0.5％。多中心研究證實(shí)發(fā)病率男女比為2:1～51,[2]主動(dòng)脈夾層早期階段死亡率極高一些嚴(yán)重并

2、發(fā)癥如重度高血壓、心包填塞、大出血、主動(dòng)脈瓣重度返流和心、腦、腎等重要臟器缺血性損傷,均可威脅患者的生命。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告約35％的主動(dòng)脈夾層患者在起病后頭24小時(shí)內(nèi)死亡,在第一周與第二周死亡率持續(xù)升高(48小時(shí)內(nèi)為50％、1周內(nèi)為70％、2周內(nèi)為80％),隨著診治技術(shù)水平的進(jìn)步,目前院內(nèi)死亡率已降至30％以下。目前,主動(dòng)脈夾層患者院外5年和10年總體生存率大約分別為80％和40％,但是本病不是終生治愈。主動(dòng)脈壁的病理過程不會(huì)完全終止,仍可能

3、發(fā)生遠(yuǎn)期并發(fā)癥主動(dòng)脈瘤樣擴(kuò)張、破裂等。目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制及預(yù)后的問題,了解得也不充分,研究發(fā)現(xiàn)胸主動(dòng)脈夾層具有一種很強(qiáng)的遺傳易感性。因此我們研究基因多態(tài)性對(duì)其發(fā)病和預(yù)后都有相關(guān)性。
　　 主動(dòng)脈夾層的發(fā)病機(jī)理研究進(jìn)展包括主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)及成分的異常改變、基因遺傳學(xué)變異,血液動(dòng)力學(xué)和血管生物力學(xué)。主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)及成分的異常改變包括中膜結(jié)構(gòu)薄弱或缺陷、細(xì)胞外基質(zhì)成分的異常、平滑肌細(xì)胞的異常、主動(dòng)脈血供削弱。
　　 主動(dòng)脈血管中膜由血管平

4、滑肌(VSMC)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白組成,主要是彈性纖維和膠原。平滑肌細(xì)胞呈梭型,胞質(zhì)內(nèi)充滿肌絲、中間絲和致密體,它們構(gòu)成平滑肌細(xì)胞的收縮系統(tǒng)和細(xì)胞骨架系統(tǒng)[3]。血管平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白組成平衡是為維護(hù)胸主動(dòng)脈重要的功能特性,特別要符合動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)。在代謝平衡紊亂,在細(xì)胞外基質(zhì)過度退化,可能導(dǎo)致血管壁逐漸惡化,擴(kuò)張和破裂。
　　 平滑肌細(xì)胞(SMC)可通過合成細(xì)胞外基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白來保證主動(dòng)脈壁的黏彈性和

5、抗壓性。30％～35％的主動(dòng)脈夾層動(dòng)脈瘤存在中膜囊性壞死(cystic medial necrosis,CMN),其以彈力纖維的破碎和丟失,平滑肌細(xì)胞(SMC)的丟失和膠原組織及嗜堿性物質(zhì)在間質(zhì)的積聚為特征[4]。
　　 細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的異常:將夾層累及的主動(dòng)脈區(qū)與相應(yīng)的正常對(duì)照區(qū)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)前者彈性蛋白、非彈性蛋白和膠原等其他蛋白的含量明顯增加,而彈性蛋白、膠原濃度明顯降低,表明AD的胸主動(dòng)脈基質(zhì)存在局部性擴(kuò)充,尤

6、其是膠原濃度的減少,意味著主動(dòng)脈壁變得更薄弱,更易發(fā)生破裂。
　　 平滑肌收縮功能障礙是導(dǎo)致主動(dòng)脈夾層的重要因素,MMP9,MYH11,TGFBR2,FBIN5都是調(diào)節(jié)血管平滑肌收縮功能的基因,而且四個(gè)基因在主動(dòng)脈夾層發(fā)病環(huán)節(jié)上發(fā)揮不同的效能,可以更深入的解釋主動(dòng)脈夾層患者之間的發(fā)病和預(yù)后的差異,以實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥,和治療,預(yù)防術(shù)前和術(shù)后的并發(fā)癥。國(guó)外研究結(jié)果顯示四個(gè)候選基因都已被證實(shí)對(duì)主動(dòng)脈夾層發(fā)病有影響,目前只有對(duì)MMP9進(jìn)行

7、了基因多態(tài)性的分析。本研究通過對(duì)我國(guó)患有主動(dòng)脈夾層病人與正常人對(duì)照,對(duì)候選基因多態(tài)性進(jìn)行分析,本文分兩部分來探討候選基因變異在主動(dòng)脈夾層發(fā)病和預(yù)后中的意義。
　　 第一部分 MYH11、MMP9、FBLN5和 TGFBR2基因多態(tài)性與主動(dòng)脈夾層的關(guān)系
　　 研究目的:分析MYH11、MMP9、FBLN5和 TGFBR2基因多態(tài)性與主動(dòng)脈夾層發(fā)病的相關(guān)性,探討遺傳因素對(duì)主動(dòng)脈夾層發(fā)病的影響
　　 對(duì)象與方法:(1)

8、病例篩選,符合入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)的患者個(gè)人資料和臨床資料的收集,剔除在研究過程中資料不夠完善以及結(jié)果欠缺的病例；(2)候選基因的選取,對(duì)所有入選病例進(jìn)行SNP基因分型檢測(cè)；
　　 1)研究對(duì)象
　　 主動(dòng)脈夾層組:入選病例為2008年12月至2010年3月就診于廣東省人民醫(yī)院的107例主動(dòng)脈夾層患者,男98例(92.3％),平均年齡為55.7歲,女9例。全部患者年齡29～81(55.7±12.2)歲。均為漢族,彼此無親緣

9、關(guān)系。對(duì)照組:我院體檢無心血管疾病患者110例,均為漢族。其中男91例(82.7％),平均年齡為55.6±14.4。主動(dòng)脈夾層的診斷均經(jīng)增強(qiáng) CT證實(shí),采用 Stanford分型,其中A型25例,B型82例。研究對(duì)象自愿參加并簽署知情同意書。
　　 2)收集資料
　　 我們對(duì)107例主動(dòng)脈夾層的病人進(jìn)行了個(gè)人資料和臨床資料的收集,我們?cè)敿?xì)記錄了患者的性別、年齡、是否吸煙、血壓、血脂、治療方案、預(yù)后等。
　　 3)

10、選擇SNP
　　 對(duì)于SNPs的選擇,本研究根據(jù)標(biāo)簽SNPs、功能性SNPs、已發(fā)表的文獻(xiàn)以及最小等位基因頻率(MAF≥10％)對(duì)MYH11的SNPs進(jìn)行了選擇。標(biāo)簽SNPs是根據(jù)Haploview軟件的Tagger程序篩選后得出,功能性SNP的選擇是根據(jù)FASTSNP基于表型和潛在的功能性影響的危險(xiǎn)因素分?jǐn)?shù),再加上SNPselector基于影響基因表達(dá)調(diào)控的保守區(qū)域、CpG島和microRNA而得到的分?jǐn)?shù)。根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)有非

11、常重要意義的SNP也選擇在內(nèi)。
　　 最后入選的MYH11的SNPs為rs1050113C>T、rs1050162G>A、rs1050111C>T、rs880071G>A,MMP9的SNPs為rs17577G>A、rs3918254C>T、rs2250889C>G、rs2274755G>T,FBLN5的SNPs為rs2430347G>A、rs2498847T>C,TGFBR2的SNPs為rs2228048C>T。
　　

12、4)基因分型
　　 取患者血樣4 mL置于硅烷化的EDTA抗凝管,顛倒幾次。立即將血樣送呈實(shí)驗(yàn)室分離白細(xì)胞,用TIANGEN公司DNA分離試劑盒提取基因組DNA(TiangenBiotech,Beijing,China)。標(biāo)本凍存于-70℃低溫冰箱。最后確定的MYH11基因的4個(gè)SNP的基因型通過基于單堿基引物延伸原理的Multiplex SNaPshot SNP分型技術(shù)(ABI Prism SNaPShotTM Multipl

13、ex kit,ABI,Foster City,CA,USA)對(duì)所有的DNA樣本進(jìn)行SNPs基因型檢測(cè)。
　　 結(jié)果:
　　 ①主動(dòng)脈夾層合并高血壓病為主動(dòng)脈夾層發(fā)病前有明確高血壓病史的患者,比較主動(dòng)脈夾層合并高血壓病與單純主動(dòng)脈夾層患者之間基因型有無相關(guān)性。說明MYH11、MMP9、FBLN5和 TGFBR2基因型與主動(dòng)脈夾層患者合并高血壓病無相關(guān)性。(P>0.05)
　　 ②漢族人 MYH11基因 rs1050

14、111C>T純合子(CC)表型的頻率最高,rs1050111C>T雜合子(CT)頻率次之,純合子(TT)頻率最低。主動(dòng)脈夾層組患者CC基因型的頻率顯著高于 CT基因型頻率；同樣,對(duì)照組中CC基因型的頻率也是顯著高于 CT基因型頻率,兩組基因型是有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。證明CC基因型的發(fā)生主動(dòng)脈夾層的風(fēng)險(xiǎn)比(OR)高于CT基因型,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P<0.05)
　　 ③以分類變量主動(dòng)脈夾層組和對(duì)照組為因變量,以 MYH11 rs1050

15、111C>T基因型作為自變量進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)因素分析,回歸分析采用進(jìn)入法。經(jīng)性別、年齡、高血壓、血糖和血脂等因素校正后,CC基因型的發(fā)生主動(dòng)脈夾層的風(fēng)險(xiǎn)比(OR)仍高于 CT基因型攜帶者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P<0.05)。
　　 ④Stanford A型的主動(dòng)脈夾層患者中MMP9基因rs117577G>A GG基因型的頻率顯著高于GA/AA基因型頻率；同樣,Stanford B型患者 GG基因型較GA/AA基因型更常見,兩組的差異有統(tǒng)

16、計(jì)學(xué)意義。(P<0.05)GA基因型的發(fā)生StanfordA型主動(dòng)脈夾層的風(fēng)險(xiǎn)比(OR)高于GG基因型。
　　 結(jié)論:
　　 ①M(fèi)YH11基因rs1050111C>T的CC基因型對(duì)主動(dòng)脈夾層的風(fēng)險(xiǎn)比(OR)高于CT/TT基因型,rs1050111C>T可能是主動(dòng)脈夾層發(fā)病的遺傳易感因素。
　　 ②MMP9基因rs117577G>A的GA基因型對(duì)StanfordA型主動(dòng)脈夾層的風(fēng)險(xiǎn)比(OR)高于GG基因型,rs11

17、7577G>A可能是主動(dòng)脈夾層StanfordA型的遺傳易感因素。
　　 第二部分MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因多態(tài)性對(duì)主動(dòng)脈夾層預(yù)后影響的研究
　　 研究目的:本研究在第一部分的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因多態(tài)性與主動(dòng)脈夾層患者的預(yù)后指標(biāo)的關(guān)系,探討遺傳因素對(duì)主動(dòng)脈夾層患者預(yù)后的影響。
　　 對(duì)象與方法:(1)病例篩選,符合入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)的患者個(gè)人

18、資料和臨床資料的收集,剔除在研究過程中資料不夠完善以及結(jié)果欠缺的病例；(2)候選基因的選取,對(duì)所有入選病例進(jìn)行SNP基因分型檢測(cè)；
　　 1)研究對(duì)象
　　 主動(dòng)脈夾層組:入選病例為2008年12月至2010年3月就診于廣東省人民醫(yī)院的107例主動(dòng)脈夾層患者,男98例(92.3％),平均年齡為55.7歲,女9例。全部患者年齡29～81(55.7±12.2)歲。均為漢族,彼此無親緣關(guān)系。對(duì)照組:我院體檢無心血管疾病患者11

19、0例,均為漢族。其中男91例(82.7％),平均年齡為55.6±14.4。主動(dòng)脈夾層的診斷均經(jīng)增強(qiáng) CT證實(shí),采用Stanford分型,其中A型25例,B型82例。研究對(duì)象自愿參加并簽署知情同意書。
　　 2)收集資料
　　 我們對(duì)107例主動(dòng)脈夾層的病人進(jìn)行了個(gè)人資料和臨床資料的收集,我們?cè)敿?xì)記錄了患者的性別、年齡、是否吸煙、血壓、血脂、治療方案、預(yù)后及并發(fā)癥等。
　　 3)選擇SNP
　　 對(duì)于SNP

20、s的選擇,本研究根據(jù)標(biāo)簽SNPs、功能性SNPs、已發(fā)表的文獻(xiàn)以及最小等位基因頻率(MAF≥10％)對(duì)MYH11的SNPs進(jìn)行了選擇。標(biāo)簽SNPs是根據(jù)Haploview軟件的Tagger程序篩選后得出,功能性SNP的選擇是根據(jù)FASTSNP基于表型和潛在的功能性影響的危險(xiǎn)因素分?jǐn)?shù),再加上SNPselector基于影響基因表達(dá)調(diào)控的保守區(qū)域、CpG島和microRNA而得到的分?jǐn)?shù)。根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)有非常重要意義的SNP也選擇在內(nèi)。

21、>　　 最后入選的MYH11的SNPs為rs1050113C>T、rs1050162G>A、rs1050111C>T、rs880071G>A,MMP9的SNPs為rs17577G>A、rs3918254C>T、rs2250889C>G、rs2274755G>T,FBLN5的SNPs為rs2430347G>A、rs2498847T>C,TGFBR2的SNPs為rs2228048C>T。
　　 4)基因分型
　　 取患者血

22、樣4 mL置于硅烷化的EDTA抗凝管,顛倒幾次。立即將血樣送呈實(shí)驗(yàn)室分離白細(xì)胞,用TIANGEN公司DNA分離試劑盒提取基因組DNA(TiangenBiotech,Beijing,China)。標(biāo)本凍存于-70℃低溫冰箱。最后確定的MYH11基因的4個(gè)SNP的基因型通過基于單堿基引物延伸原理的Multiplex SNaPshot SNP分型技術(shù)(ABI Prism SNaPShotTM Multiplex kit,ABI,Foster

23、City,CA,USA)對(duì)所有的DNA樣本進(jìn)行SNPs基因型檢測(cè)。
　　 結(jié)果:
　　 ①M(fèi)YH11 rs1050162G>A三組基因型間,攜帶MYH11 rs1050162G>A攜帶純合型(AA)和雜合型突變型(GA)的患者比純合型(GG)的患者的1年內(nèi)的發(fā)生SAE要高(X2=5.935,P=0.015),兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。純合型(GG)的OR值為2.033,95％CI:0.717,5.764,說

24、明 MYH11 rs01050162G>A純合型(AA)的基因型的患者1年內(nèi)發(fā)生MACE的風(fēng)險(xiǎn)比(OR)要高于GA/GG基因型。
　　 ②比較MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因的11個(gè)位點(diǎn)等位基因的頻率與精神癥狀的發(fā)生無顯著的差異。(P＞0.05)說明MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因與精神癥狀的發(fā)生無相關(guān)性。
　　 ③比較MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因的11個(gè)位點(diǎn)等位

25、基因的頻率與內(nèi)漏的發(fā)生無顯著的差異。(P>0.05)說明MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因與內(nèi)漏的發(fā)生無相關(guān)性。
　　 ④FBLN5的 rs2498847T>C C突變等位基因比攜帶T等位基因的患者收縮壓要高,兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。FBLN5的 rs2498847T>C的C突變等位基因的患者入院時(shí)收縮壓的風(fēng)險(xiǎn)比(OR)比T等位基因要高。
　　 結(jié)論:
　　 ①M(fèi)YH11 rs10