鏈霉菌R-,15-作用機(jī)制及β-葡萄糖苷酶的純化與特性研究.pdf

1、土壤中有益微生物種類繁多，其中放線菌占相當(dāng)大的比例。大多數(shù)種類可以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)(抗生素、β-1，3-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、β-1，6-葡聚糖酶等)。放線菌及其代謝產(chǎn)物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有較高的環(huán)境效益和經(jīng)濟(jì)效益，耐干耐熱，便于商業(yè)化生產(chǎn)，是一類具有較大應(yīng)用價值的微生物種群。隨著我國種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整及栽培環(huán)境的改變，某些植物病害的發(fā)生及危害呈逐年上升趨勢，如由卵菌(腐霉菌、疫霉菌、霜霉菌等)引起的辣椒疫病、瓜果腐霉病、瓜類疫病、煙草黑脛病

2、等病害逐年加重?；瘜W(xué)防治引起的環(huán)境污染和病原菌抗藥性的增強(qiáng)，已經(jīng)引起人們的高度重視，尋找和利用拮抗菌對病害進(jìn)行生物防治是必然趨勢。卵菌細(xì)胞壁的主要成份為纖維素，利用有益微生物所產(chǎn)纖維素酶對控制此類病害的發(fā)生及危害在理論上是可行的。但許多微生物所產(chǎn)纖維素酶中的β-葡萄糖苷酶含量相對較少，活性較低，限制了纖維素的降解效率，降低了病害防治的效果。本研究旨在對拮抗菌R15菌株種的鑒定、作用機(jī)制、菌體發(fā)酵液對3種植物的化感作用以及R15菌株所產(chǎn)β

3、-葡萄糖苷酶的分離、純化及酶特性進(jìn)行較系統(tǒng)的研究，為開發(fā)利用，研制生防菌劑提供理論依據(jù)。其結(jié)果如下： 1.通過對菌株的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征、生理生化特性等測定表明：R15菌株菌落圓形，有同心環(huán)狀，表面有皺狀隆起，邊緣整齊向四周呈放射狀擴(kuò)散，粉狀；氣生菌絲多單叉分枝，孢子絲波曲形或近松螺旋型；基絲無隔，不斷裂，孢子絲呈鏈狀直絲；明膠液化，牛奶先胨化后凝固，淀粉水解，纖維素分解，產(chǎn)硫化氫，有黑色素產(chǎn)生，幾乎利用所有測試碳源，與對照模式

4、菌株性狀基本相同。由此查對文獻(xiàn)，初步確定拮抗鏈霉菌R15菌株為金色鏈霉菌Streptomycesaureus(WaksmanetGurtis)WaksmanetHenrici。 2.平板對峙培養(yǎng)測定R15抑菌活性，結(jié)果表明R15菌株對供試的10余種植物病原菌有較好的抑制作用。其中對小麥紋枯病菌抑制作用最好，抑菌帶直徑達(dá)到14.2mm，其次為棉花枯萎病菌、棉花黃萎病菌、煙草赤星病菌、煙草黑脛病菌、辣椒疫霉病菌等，抑菌帶直徑均達(dá)10

5、mm以上。對其發(fā)酵液的穩(wěn)定性及作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，R15發(fā)酵液對棉花枯萎病菌分生孢子萌發(fā)抑制作用強(qiáng)，抑制率達(dá)98.37％。煙草赤星病菌孢子頂端膨大成球形，不形成芽管；煙草炭疽病菌孢子萌發(fā)后不能產(chǎn)生附著胞，且芽管頂端有突起。發(fā)酵液處理煙草黑脛病菌、辣椒疫霉病菌致使菌絲畸變、扭曲、菌絲壁消解；R15通過菌絲纏繞、穿透、緊貼的方式重寄生于煙草黑脛病菌菌絲上，致使菌絲斷裂。鏈霉菌R15發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性較強(qiáng)，在20-55

6、℃，pH3-9范圍內(nèi)都具有抑菌活性。 3.3個不同濃度的R15發(fā)酵液處理棉花、小麥、辣椒等3種植物，進(jìn)行皿內(nèi)沙培試驗。對供試植物的出苗歷時、根長、根重、苗高、苗重及SOD、POD酶活性等進(jìn)行測定，初步探討發(fā)酵液對3種植物的化感作用。結(jié)果表明，發(fā)酵液除對辣椒體內(nèi)POD酶活性有促進(jìn)作用外，對根長、根重、株高、苗重、體內(nèi)SOD酶活性均有不同程度的抑制；發(fā)酵液可以促進(jìn)棉花幼苗根系生長、提高體內(nèi)SOD酶活性；對小麥生理生化指標(biāo)無顯著性影響

7、。 4.R15菌株粗酶液依次經(jīng)過(NH4)2SO4分級沉淀、DEAE-52陰離子交換柱層析、SephadexG75凝膠柱層析三步，將鏈霉菌R15所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶分離純化，純化倍數(shù)16.28，回收率為14.59％，SDS-PAGE電泳測得相對分子量為63.89kDa。經(jīng)TLC分析酶解產(chǎn)物，β-葡萄糖苷酶與水楊苷反應(yīng)生成D-葡萄糖和水楊醇，證明該蛋白為β-葡萄糖苷酶。 5.酶特性研究結(jié)果表明，該酶反應(yīng)的最適溫度為65℃，7

8、0℃以下相對穩(wěn)定；最適pH為5，pH3-7之間相對酶活在75％以上；Cu2+，Hg2+，F(xiàn)e2+對β-葡萄糖苷酶有抑制作用，其中Hg2+，Cu2+的抑制作用最強(qiáng)，酶活力完全喪失，其次為Fe2+，其相對酶活力分別為62.98％，而Ca2+，Mn2+對酶均有激活作用，相對酶活分別高達(dá)137.18％和119.52％；Mg2+，Zn2+，F(xiàn)e3+，K+，Ba2+，Al3+對酶活性在P＜0.05水平上無顯著性影響。 7.酶促動力學(xué)測定結(jié)果