β-葡萄糖苷酶-絲素納米顆粒結合物的生物合成、特性及應用.pdf

1、蠶絲絲素是一種生物相容性的生物高分子蛋白纖維,經過中性鹽溶解、透析和脫鹽后獲得再生液態(tài)絲素。當將這種再生液態(tài)絲素迅速引入到能與水混溶的極性有機溶劑丙酮中,絲素蛋白因快速失水、變性而引起其結構β化,由此生成乳白色的絲素微粒。將有機溶劑去除后就可以獲得粒徑分布在40-120 nm范圍內的絲素納米顆粒。這種結晶性的絲素納米顆粒不溶于水,但經過超聲處理能良好分散在水溶液中。本文以這種絲素納米顆粒為載體,分別以交聯和包埋二種方式,制備了二種β-葡

2、萄糖苷酶-絲素納米顆粒生物結合物(即結合酶)。以游離酶為對照,利用對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(p-NPG)為底物,分析了這二種酶生物結合物的活性,并對其酶動力學等特性作了較為系統的體外評價。同時探討了這二種結合酶制備的最佳實驗條件。
　　 實驗結果表明,以戊二醛為交聯劑制備的β-葡萄糖苷酶-絲素納米顆粒在戊二醛濃度為0.25％、交聯時間5 h、交聯溫度37℃以及酶(U)與絲素納米顆粒(mg)比例為75:100條件下可獲得最佳生

3、物連接的效果；用包埋法制備的β-葡萄糖苷酶-絲素納米顆粒在酶(U)與絲素蛋白(mg)比例為1:1條件下可獲得最佳固定化效果；兩種方法所得到的生物結合酶活性回收率分別為46.0％和59.2％。酶動力學性能分析結果表明:二種結合酶和游離的β-葡萄糖苷酶特性相似,最適pH值為5.0,最適反應溫度為60℃；游離的β-葡萄糖苷酶表觀米氏常數Km=7.26×10-3 mol·L-1,而以戊二醛為交聯劑的結合酶表觀米氏常數Km(app)=1.41×1

4、0-3 mol·L-1,包埋法制備的結合酶的表觀米氏常數Km(app)’=1.01×10-2 mol·L-1,交聯酶的表觀米氏常數較游離酶的米氏常數降低5倍,這充分表明游離酶通過戊二醛與絲素納米顆粒表面的活性基團如ε-氨基等生物結合后,其酶與底物的親和性有較大提高；而包埋法制備的結合酶表觀米氏常數較游離酶的米氏常數有所增大,這可能是由于酶被絲素納米顆粒包埋后,與底物的親和性略有下降的緣故。游離酶與絲素納米顆粒結合后,無論是包埋還是交聯的

5、方式,它們的熱穩(wěn)定性都有所提高；同時也都具有良好的操作穩(wěn)定性,可以反復使用。上述結果充分表明絲素蛋白是一種酶修飾或生物結合的良好載體。
　　 柚苷酶由α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶組成的復合酶,以戊二醛為交聯劑,
　　 將這二種酶共固定在絲素納米顆粒表面,制備成柚苷酶-絲素納米顆粒結合物。以柚皮苷為底物,采用高效液相色譜法(HPLC)測定這種柚苷酶-絲素納米顆粒生物結合物的酶活性。實驗結果表明,柚苷酶與絲素納米顆粒共

6、同連接后仍然能夠很好的水解柚皮苷,表明其酶活性沒受影響。酶動力學性能分析結果表明,結合酶和游離柚苷酶的特性相似,最適反應溫度為55℃；這種柚苷酶-絲素納米顆粒結合物與底物柚皮苷發(fā)生酶促反應后,可以通過高速離心沉淀方法將結合酶與產物(柚皮素和鼠李糖和葡萄糖)分開,沉淀的絲素納米顆粒結合酶再經過超聲懸浮后,可以繼續(xù)進行酶促反應,當這種連續(xù)的反復酶促反應進行8次后,仍能保持70％左右原有酶活性。因此,絲素蛋白不僅是一種酶而且是二種酶修飾或生物