魚(yú)類(lèi)淋巴囊腫病毒核酸檢測(cè)診斷技術(shù)的研究.pdf

1、由淋巴囊腫病毒(Lymphocystisdiseasevirus，LCDV)引起的淋巴囊腫病主要表現(xiàn)為一種慢性皮膚瘤，通常發(fā)生于魚(yú)的體表皮膚、鰭等處。目前，該病在世界范圍內(nèi)已感染了包括海水、淡水和半咸水的42科125種以上的魚(yú)類(lèi)。自從1992年，我國(guó)在養(yǎng)殖的石斑魚(yú)、紅魚(yú)中發(fā)現(xiàn)淋巴囊腫病以來(lái)，受感染的魚(yú)類(lèi)已有真鯛(Pagrosomusmajor)、鱸(Lateolabraxjaponica)、紫紅笛鯛(Lutjanusargentimac

2、ulatus)和牙鲆(Paralichthysolivaceus)等10余種。淋巴囊腫病是一種慢性疾病，潛伏期長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)星期，發(fā)病后的魚(yú)體外觀(guān)丑陋，使之喪失商品價(jià)值，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，制約了海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，建立淋巴囊腫病的早期檢測(cè)和診斷技術(shù)對(duì)控制該病的發(fā)生和蔓延顯得尤為重要。 在國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目的資助下，本文建立了淋巴囊腫病毒的核酸檢測(cè)診斷技術(shù)，并開(kāi)展了該病流行情況的調(diào)查。 取青島市黃島某養(yǎng)殖場(chǎng)具典型

3、癥狀的牙鲆體表囊腫，經(jīng)勻漿機(jī)勻漿、凍融三次、手動(dòng)勻漿、超聲波破碎后，通過(guò)差速離心和蔗糖密度梯度離心，在37％～40％和47％～50％的蔗糖界面上有折光帶形成。經(jīng)負(fù)染，透射電鏡觀(guān)察后發(fā)現(xiàn)37％～40％帶中病毒粒子較少，雜質(zhì)較多；47％～50％帶中病毒粒子密度大，基本沒(méi)有雜質(zhì)，且病毒完整，直徑約為230nm。 病毒粒子經(jīng)蛋白酶K和SDS消化后，用苯酚/氯仿抽提法提取病毒核酸，產(chǎn)量約為2.30μg/μl。病毒基因組DNA用BanⅡ、B

4、glⅡ、ScaⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HincⅡ和BamHⅠ酶切后，形成的片段數(shù)目分別為4、11、10、10、6、17和4。以λDNA/HindⅢ酶切片段和DNAMarkerDL2,000作為標(biāo)準(zhǔn)，用Bio-RadQuantityOne軟件計(jì)算出各酶切片段的分子量，由各酶切片段總和計(jì)算出LCDV青島分離株的基因組DNA大小平均值約為56.0kb，即Mr約為37.0×106D。病毒DNA經(jīng)HpaⅡ和MspⅠ酶切進(jìn)行的甲基化分析表明，病毒

5、基因組DNA能被對(duì)CpG甲基化修飾不敏感的MspⅠ切開(kāi)，而不能被CpG甲基化修飾敏感的HpaⅡ切開(kāi)，由此證明LCDVDNA胞嘧啶5'端高度甲基化。 根據(jù)LCDV的主要核衣殼蛋白基因序列(GenBank：AF126405)，設(shè)計(jì)了一步PCR和巢式PCR引物。在根據(jù)Primerpremier5.0分析獲得的引物退火溫度基礎(chǔ)上，分別采用在47.0、48.1、49.0、50.2和51.4℃不同的退火溫度來(lái)進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，二種PCR反應(yīng)

6、的特異性均沒(méi)有受到影響，各反應(yīng)都可從LCDVDNA中擴(kuò)增出特異性的目的片段，而對(duì)健康牙鲆組織DNA呈陰性反應(yīng)；在不同退火溫度下，巢式PCR擴(kuò)增效率不變，而一步PCR則不同，在退火49.0℃的時(shí)候，特異性產(chǎn)物的量最大。將LCDVDNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后分別作為模板，一步PCR和巢式PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：一步PCR可檢測(cè)出低至1×10-4μg的病毒DNA，而巢式PCR技術(shù)，低至1×10-9μg的病毒DNA即可被檢出，這說(shuō)明以上兩種P

7、CR檢測(cè)技術(shù)具有高度的特異性和靈敏性。 利用含digoxigenin-11-dUTP的dNTP混和液，通過(guò)一步PCR反應(yīng)合成了地高辛(DIG)標(biāo)記核酸探針，在此基礎(chǔ)上分別建立了斑點(diǎn)雜交(Dot-Blot)檢測(cè)技術(shù)和原位雜交檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)Dot-Blot檢測(cè)表明，探針可以特異性地與病毒DNA進(jìn)行結(jié)合，而與健康牙鲆組織DNA的雜交反應(yīng)呈陰性。將LCDVDNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后分別作為模板，Dot-Blot靈敏度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：Do

8、t-Blot的最小檢測(cè)量為l00ng病毒DNA。經(jīng)冰凍切片后進(jìn)行原位雜交檢測(cè)，在囊腫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的藍(lán)黑色的細(xì)胞沉淀物，主要聚集在細(xì)胞的邊緣部分，石蠟切片后H&E染色確定這些沉淀物為嗜堿性的包涵體，表明通過(guò)原位雜交可以在組織細(xì)胞內(nèi)直接定位病毒的原有位置。 LCDV基因組DNA用BanⅡ、BglⅡ、ScaⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HincⅡ和BamHⅠ酶切后，使用DIG標(biāo)記的核酸探針，對(duì)其進(jìn)行了Southern雜交分析，結(jié)

9、果表明：在BanⅡ-A(30.4kb)、BglⅡ-C(8.4kb)、ScaⅠ-A(19.3kb)、EcoRⅠ-A(19.3kb)、PstⅠ-B(19.8kb)、HincⅡ-E(4.0kb)和BamHⅠ-A(28.2kb)酶切片段上，各有一條雜交陽(yáng)性帶。 應(yīng)用本文建立的PCR和原位雜交兩種技術(shù)，對(duì)淋巴囊腫病流行情況初步調(diào)查的結(jié)果顯示：該病流行范圍廣，可感染多種魚(yú)類(lèi)，包括牙鲆(Paralichthysolivaceus)、黑鲪(Se

10、bastodesfuscescens)、紋腹叉鼻鲀(Arothronhispidus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、紅頭魚(yú)(Lepidoriglamicroptera)和鱸魚(yú)(Lateolabraxjaponicus)。本研究分析推測(cè)，LCDV可通過(guò)近海海域野生魚(yú)或由鮮活餌料傳染給我國(guó)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)、觀(guān)賞魚(yú)類(lèi)。在利用PCR技術(shù)檢測(cè)不同地域LCDV時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用韓國(guó)檢測(cè)LCDV引物檢測(cè)我國(guó)北方地區(qū)患病牙鲆時(shí)，其擴(kuò)增片段大小與