淋巴囊腫病毒（Lymphocystis disease virus）核酸疫苗的免疫效果評價及安全性研究.pdf

1、隨著人們對水產(chǎn)品需求量的增加，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到了快速發(fā)展。但大規(guī)模高密度養(yǎng)殖造成的水環(huán)境污染，致使水產(chǎn)病害日趨嚴(yán)重，特別是病毒性疾病造成的損失更加驚人。淋巴囊腫病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)，屬于虹彩病毒科(Iridovhidae)病毒，是在我國養(yǎng)殖牙鲆、真鯛、大菱鲆、軍曹魚以及野生蝦祜魚等多種魚中暴發(fā)的首例病毒。目前，世界上報(bào)道的、可被淋巴囊腫病毒感染的魚類至少有42科、125種以上，其中海水魚占

2、30科。 繼南方養(yǎng)殖石斑魚中發(fā)生淋巴囊腫病以來，1997年山東省榮成市養(yǎng)殖牙鲆也發(fā)生了此病，后來迅速蔓延到威海、乳山、青島等主要養(yǎng)殖區(qū)；1998年，河北省唐山、樂亭等也大量發(fā)生該病毒病。由于魚類被感染后，其口唇、鰓、鰭、尾及體表各處會長出大小不一的腫瘤，形象丑陋、活力減弱，有直接或間接的死亡，所以造成的經(jīng)濟(jì)損失是嚴(yán)重的。 當(dāng)前，我國海水魚養(yǎng)殖者大多使用化學(xué)合成或抗生素類藥物“抵抗”疾病，但由于藥物殘留、誘變抗藥菌株及水體

3、污染等副作用，導(dǎo)致了我國水產(chǎn)品在出口時遇到種種障礙、嚴(yán)重阻礙了經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。近年的研究認(rèn)為，基因工程疫苗，是在病毒病防治中替代化學(xué)藥品和抗生素的最好選擇。與傳統(tǒng)疫苗相比，核酸疫苗具有獨(dú)特的優(yōu)勢，如生產(chǎn)成本低、可與其他免疫原組成多價疫苗、可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈而持久的體液免疫和細(xì)胞免疫并具有良好的安全性等。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖界核酸疫苗研究尚處于起步階段，國外主要集中在鮭、鱒魚類的IHNV、VHSV、SVCV、SHRV等傳染性病毒病的防治上。但迄今未

4、見淋巴囊腫病毒基因工程疫苗的研究報(bào)道。 本論文對應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建的牙鲆淋巴囊腫病毒核酸疫苗DEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb以及應(yīng)用生物信息學(xué)設(shè)計(jì)的6種核酸疫苗 (pcDNA3.1+/LTEl,2,3和pcDNA3.1+/L29A，B，C)在真核細(xì)胞COS7及牙鲆胚胎干細(xì)胞(FEC)中的表達(dá)定位進(jìn)行了研究；并在牙鲆體內(nèi)進(jìn)行了免疫效果評價；對核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb在牙鲆體內(nèi)

5、的存留部位、時間及表達(dá)、安全性及兩種免疫佐劑脂質(zhì)體和CpG基序的免疫激活作用進(jìn)行了研究，并初步探討了其免疫機(jī)制。上述研究為淋巴囊腫病毒核酸疫苗的生產(chǎn)應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化提供了重要的理論依據(jù)。本論文的主要成果如下:1、對本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用分子克隆技術(shù)和生物信息學(xué)方法構(gòu)建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb及pcDNA3.1+/LTE 1,2,3和pcDNA3.1+/L29A,B,C進(jìn)行了在真核細(xì)胞COS7和牙鲆胚胎干細(xì)胞(FEC

6、)中的表達(dá)定位研究。結(jié)果表明,幾種核酸疫苗均可在COS7及FEC等真核細(xì)胞中有效表達(dá)。 2、重組質(zhì)粒在牙鲆體內(nèi)的分布與表達(dá)研究,結(jié)果顯示,免疫接種7d后,注射點(diǎn)周圍肌肉、注射點(diǎn)對面體側(cè)肌肉、腸、鰓、腎、肝、脾臟、生殖腺各部位都存在質(zhì)粒;3個月后,除注射部位外、各組織基本檢測不到質(zhì)粒的存在。熒光顯微檢測顯示:實(shí)驗(yàn)組在接種核酸疫苗后84h,注射點(diǎn)周圍肌肉、注射點(diǎn)對面體側(cè)肌肉、腸、鰓、腎、脾臟、肝等部位均有熒光表達(dá),60d熒光減弱,9

7、0d脾臟仍有弱熒光,對照組無黃綠色熒光。RT-PCR檢測結(jié)果顯示:免疫接種后第7d和第20d,牙鲆不同組織內(nèi)均有624bp的目的基因表達(dá)。因此,核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb可分布于受免牙鲆不同的組織內(nèi)、并在一定時間內(nèi)持續(xù)表達(dá),從而可不斷提供抗原并刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。 3、不同注射途徑和劑量的免疫效果研究表明,牙鲆肌肉及皮下注射0.1μg核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6k

8、b,22d后外周血、脾臟、前腎和腸粘膜中的淋巴細(xì)胞增殖及呼吸爆發(fā)明顯增強(qiáng),且隨劑量的增加而增強(qiáng);但15μg的劑量與5μg的劑量淋巴細(xì)胞增殖以及呼吸爆發(fā)活性增加差別不大。 研究表明,肌肉注射疫苗時,初期抗體水平略低于皮下注射、但后期明顯升高、且抗體水平隨劑量增加而提高。肌肉注射對淋巴細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)優(yōu)于皮下注射。本研究結(jié)果說明,該核酸疫苗可激活牙鲆的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)。 4、佐劑對核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-M

9、CP0.6kb的免疫效果研究表明,脂質(zhì)體、CpG ODN-2006和CpG ODN-1670序列,均可顯著增強(qiáng)該核酸疫苗的免疫活性、提高牙鲆的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答,是有應(yīng)用前景的核酸疫苗佐劑。 5、肌注核酸疫苗后,牙鲆體內(nèi)MHCⅠ、Ⅱ的表達(dá)研究證明:MHCI在鰓、后腸和脾臟中高度表達(dá);在血液、肝臟和頭腎中度表達(dá);在心臟和肌肉中低度表達(dá);免疫接種7d后肝臟、頭腎的表達(dá)增加;后腸略有減少,肌肉、血液等沒有變化;免疫接種20d后心臟

10、、血液、頭腎、肝臟的表達(dá)增加；肌肉、脾臟、后腸等沒有變化。MHCII在脾臟、鰓、頭腎中高度表達(dá)，在后腸、血液、肝臟中度表達(dá)，在肌肉、心臟中很低或稍微可見的表達(dá)； MHCII免疫接種7d后脾臟、頭腎、鰓的表達(dá)增加，后腸略有減少，其他組織沒有變化；免疫接種20d后脾臟、頭腎、血液的表達(dá)增加，心臟略有增加，其他組織沒有變化。 6、核酸疫苗的安全性研究表明，pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0．6kb不與牙鲆染色體發(fā)生整合，也不