中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位腺病毒核酸疫苗的制備及免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、第一部分覆蓋中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位的確定及預(yù)測(cè) 目的：覆蓋中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位的確定及預(yù)測(cè)。 方法： 1、根據(jù)山東大學(xué)衛(wèi)生系統(tǒng)計(jì)教研室薛付忠老師建立的中國HLA-Ⅰ積累表型頻率（CPF）空間預(yù)測(cè)系統(tǒng)依次預(yù)測(cè)A2，A24，A1，A3，A11，A68，B44，B7，A23，A26，B35，B38，B8，B27十四個(gè)基因位點(diǎn)在中國人群的覆蓋率（CPF值），評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)HLA特異的HCMV串聯(lián)

2、表位核酸疫苗在中國不同地理位置上人群內(nèi)的免疫效果； 2、利用從1996年以來發(fā)表在PubMed上被SCI收錄的23篇研究HCMV表位的文獻(xiàn)，從中選擇能針對(duì)HCMV多種蛋白抗原的多個(gè)CTL表位、Th表位和B細(xì)胞表位，能夠激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，且能與HLA-Ⅰ分子和HLA-Ⅱ分子的基因位點(diǎn)穩(wěn)定結(jié)合的表位； 3、利用SYFPEITHI MHC表型及表位預(yù)測(cè)系統(tǒng)和MAPPP蛋白酶體降解預(yù)測(cè)系統(tǒng)對(duì)所選表位進(jìn)行表位肽

3、預(yù)測(cè)和MAPPP蛋白酶體切割-表位生成預(yù)測(cè)； 4、從PubMed Nucleotide NC_001347.人巨細(xì)胞病病毒AD169株各蛋白的基因序列中找出各表位相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列并核對(duì)，將各表位的核苷酸序列按等位基因的頻率分布順序排列起來，串聯(lián)成一條核苷酸序列； 5.根據(jù)Kozak規(guī)則引入Kozak序列以獲得HCMV串聯(lián)表位核苷酸序列在真核表達(dá)載體中的高效表達(dá)； 6.將HCMV串聯(lián)表位的核苷酸序列輸入DNAMA

4、N軟件，根據(jù)輸出的酶切位點(diǎn)結(jié)果結(jié)合所要構(gòu)建入穿梭載體的多克隆位點(diǎn)，確定串聯(lián)表位核苷酸序列兩端的酶切位點(diǎn)。 結(jié)論： 1、根據(jù)山東大學(xué)衛(wèi)生系統(tǒng)計(jì)教研室薛付忠老師建立的中國HLA-Ⅰ積累表型頻率（CPF）空間預(yù)測(cè)系統(tǒng)，對(duì)所選HCMV表位結(jié)合的14個(gè)HLA基因位點(diǎn)及其組合進(jìn)行了預(yù)測(cè)，顯示A2，A24，A1，A3，A11五個(gè)優(yōu)勢(shì)基因位點(diǎn)的CPF值是88.1％，；A2，A24，A1，A3，A11，A68，B44，B7，A23，A26

5、，B35，B38，B8，B27十四個(gè)基因位點(diǎn)的CPF值是92.1％，顯示HLA特異的HCMV串聯(lián)表位核酸疫苗在中國人群的覆蓋頻率達(dá)90％以上，預(yù)測(cè)了HLA特異的HCMV串聯(lián)表位核酸疫苗在中國不同地理位置上人群內(nèi)的免疫效果，理論上其免疫效果可達(dá)90％以上。 2、我們選擇了HCMV的十五種抗原蛋白pp28，pp50，pp65，pp150，pp71，gH，gB，IE-1，IE-2，US2，US3，US6，US11，UL16，UL18，

6、分別在病毒的黏附、復(fù)制、組裝及再激活過程中表達(dá)，在這些抗原中選取了84個(gè)表位，其中針對(duì)HLA-Ⅰ分子基因位點(diǎn)的CTL表位76個(gè)，針對(duì)HLA-Ⅱ分子基因位點(diǎn)的Th表位7個(gè)，能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的B細(xì)胞表位1個(gè)，通過啟動(dòng)針對(duì)上述抗原表位的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，理論上可以在各個(gè)階段控制病毒的復(fù)制，防止HCMV疾病的形成。 3、應(yīng)用DNAMAN軟件、Kozak規(guī)則及PubMed Nucleotide NC 001347.Human he

7、rpesvirus 5 strain AD169 HCMV基因組得出了覆蓋中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位核苷酸序列，在起端加上了Kozak序列，可以獲得串聯(lián)表位核苷酸序列在真核表達(dá)載體中的高效表達(dá)；末端加上了6個(gè)His標(biāo)簽序列，可以通過6個(gè)His抗體應(yīng)用Western blot及細(xì)胞免疫組化檢測(cè)HCMV串聯(lián)表位的表達(dá)；起始兩端加入了NheⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，可以插入穿梭載體pHMCMV5載體的多克隆位點(diǎn)，為制備中國人群HLA特異

8、的HCMV串聯(lián)表位腺病毒載體核酸疫苗打下了基礎(chǔ)。 第二部分 中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位腺病毒核酸疫苗的制備 目的：HCMV感染是引起移植患者和新生兒高發(fā)病率和死亡率的原因，世界范圍的醫(yī)學(xué)會(huì)組織指出應(yīng)優(yōu)先發(fā)展控制HCMV疾病的疫苗，盡管做出了很大的努力但目前仍無被臨床許可的疫苗：嵌合型復(fù)制缺陷型腺病毒載體Ad5F35比傳統(tǒng)的Ad5型具有更好的趨向性和更高的容納外源基因的能力，在多種細(xì)胞上高效表達(dá)外源基因。本實(shí)驗(yàn)

9、應(yīng)用嵌合型Ad5F35構(gòu)建多重HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ分子限制CTL、Th多表位核酸疫苗Ad5F35-CTL·Th以及針對(duì)體液免疫應(yīng)答的HCMV線性B細(xì)胞表位核酸疫苗Ad5F35-AD-1。 方法： 1、采用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法（Gene splicing by overlap extension，SOEing）和PCR技術(shù)合成HCMV串聯(lián)T細(xì)胞表位全長基因； 2、應(yīng)用PCR技術(shù)從HCMV AD169全基因組擴(kuò)增線

10、性B細(xì)胞表位gB AD-1的基因； 3、利用同源重組技術(shù)從穿梭載體，將CTL·Th和AD-1基因分別插入pHMCMV5的NheⅠ/NotⅠ和KpnⅠ/Afl Ⅱ酶切位點(diǎn)，構(gòu)建穿梭載體pHMCMV5-CTL·Th和pHMCMV5-AD-1，應(yīng)用NheⅠ/NotⅠ和KpnⅠ/ArlⅡ酶切分析和測(cè)序分析鑒定目的載體； 4、利用Ⅰ-CeuⅠ/PⅠ-SceⅠ雙酶切和體外重組技術(shù)將穿梭載體上包含CMV啟動(dòng)子、目的基因、SV40 p

11、olyA尾的表達(dá)盒插入腺病毒表達(dá)載體pAd5F35，構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)載體Ad5F35-CTL·Th和pAd5F35-AD-1，應(yīng)用XhoⅠ和Ⅰ-CeuⅠ /PⅠ-SceⅠ酶切分析和測(cè)序分析鑒定目的載體； 5、應(yīng)用PacⅠ線性化重組腺病毒表達(dá)載體Ad5F35-CTL·Th和pAd5F35-AD-1，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染HEK293，包裝重組腺病毒Ad5F35-CTL·Th和Ad5F35-AD-1，待培養(yǎng)10天出現(xiàn)CPE效應(yīng)時(shí)收取

12、病毒； 6、應(yīng)用HEK293細(xì)胞大量擴(kuò)增重組腺病毒Ad5F35-CTL·Th和Ad5F35-AD-1，擴(kuò)增至五代，應(yīng)用快速腺病毒感染性滴度（TCID50）檢測(cè)試劑盒測(cè)定大量擴(kuò)增后的的重組腺病毒的滴度； 7、用重組腺病毒Ad5F35-CTL·Th和Ad5F35-AD-1分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用RT-PCR和Western blot技術(shù)分析CTL·Th和AD-1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)； 8、用重組腺病毒Ad

13、5F35-CTL·Th和Ad5F35-AD-1分別轉(zhuǎn)染PBMC，利用細(xì)胞免疫化學(xué)和臺(tái)盼蘭染色分析重組腺病毒在PBMC上的表達(dá)和對(duì)PBMC活性的影響。 結(jié)論： 1、我們成功制備出中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)T細(xì)胞表位腺病毒載體核酸疫苗Ad5F35-CTL·Th和針對(duì)體液免疫應(yīng)答的HCMV線性B細(xì)胞表位腺病毒載體核酸疫苗Ad5F35-AD-1，為下一步的免疫應(yīng)答實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。 2、重組腺病毒疫苗Ad5F35-C

14、TL·Th和Ad5F35-AD-1可以在PBMC高效表達(dá)目的蛋白，且不影響PBMC的活性。 第三部分 中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位腺病毒核酸疫苗體外免疫效果評(píng)價(jià) 目的：過繼免疫包括體液免疫和細(xì)胞免疫在控制HCMV感染方面起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)中國人群HLA特異的HCMV串聯(lián)表位腺病毒核酸疫苗的體外免疫效果。 方法： 1、用EBV轉(zhuǎn)化PBMC，建立類淋巴母細(xì)胞系（lymphoblastoid ce

15、ll lines-LCL）； 2、應(yīng)用HCMV多表位腺病毒載體疫苗Ad5F35-CTL·Th刺激HCMV健康攜帶者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），體外擴(kuò)增抗原特異性CTL； 3、應(yīng)用抗原特異性CTL進(jìn)行細(xì)胞毒試驗(yàn)，檢測(cè)CTL的殺傷活性； 4、應(yīng)用ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ad5F35-CTL·Th刺激HCMV健康攜帶者的PBMC后和抗原特異性CTL分泌IFN-γ的情況； 5、細(xì)胞內(nèi)染色法檢測(cè)Ad5F35-C

16、TL·Th刺激HCMV健康攜帶者的PBMC后CD8+T細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)。 結(jié)論： 1、本實(shí)驗(yàn)顯示了多表位抗原提呈系統(tǒng)擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞的有效性。 2、本試驗(yàn)顯示了HCMV多表位腺病毒核酸疫苗可以高效擴(kuò)增免疫顯性和亞顯性的抗原特異性T細(xì)胞。 3、實(shí)現(xiàn)了單個(gè)表達(dá)結(jié)構(gòu)可以擴(kuò)增免疫顯性和亞顯性的抗原特異性T細(xì)胞，較之以前擴(kuò)增不同的抗原特異性T細(xì)胞需要不同的刺激策略具有強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。 4、我們的多表位重組