中國(guó)人群移植抗原特異慢粒白血病表位疫苗制備及免疫活性研究.pdf

1、研究背景
　　慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)是一種造血干細(xì)胞慢性克隆增殖性疾病。BCR/ABL融合基因或費(fèi)城染色體為其特征性的形態(tài)學(xué)異常。BCR/ABL融合基因同時(shí)也表達(dá)于一部分急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的病人中。酪氨酸激酶阻滯劑的出現(xiàn)使得慢性粒細(xì)胞性白血病的治療取得了巨大的進(jìn)展，但是由于微小殘留病變的存在以及耐藥的出現(xiàn)，慢性粒細(xì)胞性白血病仍難以治愈。因此，如何清除微小殘留病變成為治療白血病過(guò)程中的重要問(wèn)題。有研究報(bào)道，包括疫苗在

2、內(nèi)的免疫療法對(duì)CML的治療有一定的療效。來(lái)源于P210融合蛋白的多肽在體外可誘導(dǎo)出MHC限制性的T淋巴細(xì)胞的增殖。另外，WT1基因也表達(dá)于慢性粒細(xì)胞性白血病及急性淋巴細(xì)胞白血病中，因此，WT1多肽也可誘導(dǎo)出特異性的免疫反應(yīng)，用來(lái)治療CML的微小殘留病變。目前，BCR/ABL及WT1多肽疫苗已取得了巨大的進(jìn)展，但是，這些疫苗大多只針對(duì)以單一HLA表位并大多適用于歐美人群。因此，針對(duì)于中國(guó)人群HLA表型的多肽疫苗有待于進(jìn)一步研究。
　

3、　目的
　　通過(guò)篩選針對(duì)CML多種抗原蛋白的免疫表位，合成一條對(duì)應(yīng)各抗原表位的串聯(lián)核苷酸序列，包裝入慢病毒過(guò)表達(dá)系統(tǒng)，感染DC細(xì)胞，制備成HLA特異性慢性粒細(xì)胞性白血病表位疫苗，并在體外對(duì)其進(jìn)行免疫活性研究。為慢性粒細(xì)胞性白血病的免疫治療提供了新的方向。
　　方法
　　1、多肽表位的選擇:通過(guò)查閱CML表位相關(guān)文獻(xiàn)，從中選取針對(duì)CML抗原蛋白的免疫表位，通過(guò)SYFPEITHIMHC表型及表位預(yù)測(cè)系統(tǒng)和MAPPP蛋白酶體

4、降解預(yù)測(cè)系統(tǒng)對(duì)所選表位進(jìn)行表位肽預(yù)測(cè)和MAPPP蛋白酶體切割-表位生成預(yù)測(cè)后，通過(guò)重疊區(qū)擴(kuò)增基因法及PCR技術(shù)合成CML串聯(lián)表位全長(zhǎng)基因。
　　2、HLA特異慢粒白血病DC疫苗的制備及鑒定:利用基因工程的相關(guān)方法把目的基因包裝入慢病毒過(guò)表達(dá)系統(tǒng)。收集正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，體外誘導(dǎo)DC細(xì)胞。重組慢病毒感染DC細(xì)胞后制備成HLA特異慢粒白血病疫苗。實(shí)時(shí)熒光定量方法(qRT-PCR)檢測(cè)目的基因在慢病毒感染后的DC細(xì)胞中的

5、mRNA水平的表達(dá)情況。且在熒光顯微鏡下觀察DC細(xì)胞內(nèi)熒光的表達(dá)。
　　3、HLA特異慢粒白血病疫苗的體外免疫活性鑒定:免疫磁珠方法分選PBMC中的CD3+T淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)所分選的T淋巴細(xì)胞的純度。DC疫苗與CD3+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后激活其成為CTL細(xì)胞，CTL細(xì)胞與靶細(xì)胞共培養(yǎng)，乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗(yàn)測(cè)定T細(xì)胞的殺傷效率;ELISPOT方法檢測(cè)CTL細(xì)胞IFN-γ的分泌。
　　結(jié)果
　　1、通過(guò)S

6、YFPEITHI和MAPPP預(yù)測(cè)及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選取50個(gè)免疫表位，這些免疫表位包含多種不同HLA表型的BCR/ABL及WT1抗原。
　　2、成功合成CML串聯(lián)表位全長(zhǎng)基因，并且成功包裝入慢病毒過(guò)表達(dá)系統(tǒng)。在體外成功誘導(dǎo)出DC細(xì)胞，并將慢病毒感染DC細(xì)胞，制備成HLA特異慢粒細(xì)胞DC疫苗。PCR證實(shí)目的基因在DC細(xì)胞中成功表達(dá)。熒光顯微鏡下可觀察到病毒感染后的DC細(xì)胞中有熒光表達(dá)。
　　3、LDH釋放試驗(yàn)證實(shí)實(shí)驗(yàn)組T細(xì)胞殺傷