牛源犬新孢子蟲AMA1基因核酸疫苗與重組腺病毒疫苗的制備及動物免疫.pdf

1、新孢子蟲病是由犬新孢子蟲引起牛和其它動物的重要的原蟲病，該病可引起牛的流產(chǎn)、死胎及神經(jīng)系統(tǒng)障礙疾病，已給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。對新孢子蟲病的防控目前尚無有效的方法。目前，以病毒為載體的疫苗得到了廣泛研究，其中腺病毒載體疫苗在寄生蟲領(lǐng)域也得到了應(yīng)用且卓見成效，而以DNA疫苗初免、病毒載體疫苗加強(qiáng)免疫的策略在誘導(dǎo)接種動物體液免疫和細(xì)胞免疫方面顯示了良好的效果。
　　本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中（AB265823.1）已公布的犬新孢

2、子蟲AMA1基因序列，設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增 AMA1基因的兩對特異性引物，應(yīng)用 RT-PCR方法對牛源犬新孢子蟲吉林株AMA1基因進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的AMA1基因克隆至pMD18-T simple載體，將測序正確的AMA1基因分別亞克隆至 pVAX-1真核表達(dá)載體與pCR259腺病毒穿梭載體。將構(gòu)建的pVAX1-AMA1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Vero細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，并通過間接免疫熒光和western blot檢測其表達(dá)產(chǎn)物，之后通過質(zhì)粒中提試劑盒大提p

3、VAX1-AMA1質(zhì)粒，制備核酸疫苗。同時(shí)將構(gòu)建的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pCR259-NcAMA1依次轉(zhuǎn)化HighQ-1 Transpose-Ad294和HighQ-1感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建并純化犬新孢子蟲 AMA1基因重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒294-AMA1。通過脂質(zhì)體將線性化的294-AMA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至QBI-HEK293細(xì)胞以包裝 Ad5-NcAMA1重組腺病毒。通過 IFAT和 Western blot檢測犬新孢子蟲AMA1基因在QBI-HEK

4、293細(xì)胞中的表達(dá)。獲得的Ad5-NcAMA1病毒滴度為5.62×109/mL，大量擴(kuò)增、純化后制備重組腺病毒載體疫苗。
　　應(yīng)用制備的核酸疫苗和腺病毒疫苗，按照Prime-Boost免疫組、Ad5-NcAMA1重組腺病毒免疫組、pVAX1-AMA1核酸疫苗組及PBS對照組對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫接種。通過間接 ELISA測定小鼠 IgG、IgG1及 IgG2a抗體水平；通過ELISA試劑盒檢測 IFN-γ與 IL-4細(xì)胞因子水

5、平；通過流式細(xì)胞儀檢測小鼠的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群變化。
　　結(jié)果顯示，擴(kuò)增的牛源犬新孢子蟲吉林株 AMA1基因大小為1695 bp，與GenBank中AMA1基因（AB265823.1）核苷酸同源性為99.9％，氨基酸同源性為99.8%。構(gòu)建的pVAX1-AMA1真核表達(dá)質(zhì)粒及重組腺病毒質(zhì)粒均可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)蛋白分子量約為68 kDa。BALB/c小鼠接種分析表明，Prime-Boost免疫組 IgG抗體水平均

6、極顯著高于 pVAX1-AMA1核酸疫苗組（P<0.01)與Ad5-NcAMA1免疫組（P<0.01)；Prime-Boost免疫組 IgG1水平顯著高于Ad5-NcAMA1免疫組（P<0.05)與pVAX1-AMA1核酸疫苗組（P<0.05)；Prime-Boost免疫組 IgG2a抗體水平顯著高于 pVAX1-AMA1核酸疫苗組（P<0.05)，與Ad5-NcAMA1免疫組差異不顯著。Prime-Boost免疫組IL-4水平顯著高于

7、病毒免疫組 Ad5-NcAMA1（p<0.05），極顯著高于 pVAX1-AMA1免疫組（p<0.01）；Prime-Boost免疫組IFN-γ水平顯著高于pVAX1-AMA1核酸疫苗組（P<0.05)，與病毒免疫組Ad5-NcAMA1差異不顯著。CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群分析表明，Prime-Boost免疫組 CD4+均顯著高于 Ad5-NcAMA1免疫組（P<0.05)與pVAX1-AMA1核酸疫苗組（P<0.05)；CD4+