牛源犬新孢子蟲NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因核酸疫苗與重組腺病毒疫苗的研究.pdf

1、新孢子蟲病是嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的重要繁殖障礙性疾病，該病可垂直傳播，帶蟲母牛可將蟲體直接傳給新生犢牛，隨著我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展和牛的頻繁交易，該病在我國的流行區(qū)域逐漸擴(kuò)大。目前，國內(nèi)外對新孢子蟲病的研究都局限在病原學(xué)、分子生物學(xué)、流行病學(xué)、診斷和免疫學(xué)方面，但對新孢子蟲病的防控尚無有效的方法。因此，本研究提取牛源犬新孢子蟲基因組DNA，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增牛源犬新孢子蟲表面蛋白基因NcSRS2和致密顆粒蛋白基因NcGRA7，SOE-PCR

2、技術(shù)拼接NcSRS2和NcGRA7基因，構(gòu)建NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因重組克隆質(zhì)粒、重組真核質(zhì)粒、重組腺病毒穿梭質(zhì)粒及重組腺病毒，制備NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因核酸疫苗和重組腺病毒疫苗，應(yīng)用Prime-Boost免疫策略及單一疫苗分別接種BABL/c小鼠，測定體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，并進(jìn)行攻蟲試驗(yàn)，評價(jià)免疫保護(hù)性，以期為牛的新孢子蟲病新型疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　1、牛源犬新孢子蟲NcSRS2-NcGRA7復(fù)合

3、基因的克隆與生物信息學(xué)分析
　　提取牛源犬新孢子蟲基因組DNA，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增犬新孢子蟲表面蛋白基因NcSRS2和致密顆粒蛋白基因NcGRA7，SOE-PCR技術(shù)拼接NcSRS2和NcGRA7基因，構(gòu)建NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因重組克隆質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR鑒定、雙酶切鑒定及生物信息學(xué)分析。結(jié)果，NcSRS2基因擴(kuò)增片段大小為1061 bp，NcGRA7基因擴(kuò)增片段大小為364 bp，NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因擴(kuò)增

4、片段大小為1482 bp；獲得重組克隆質(zhì)粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7經(jīng)PCR鑒定、雙酶切鑒定正確；測序分析表明，與GenBank中已發(fā)表的美國株犬新孢子蟲（AF061249、AF176649）核苷酸序列同源性為99％；經(jīng)DNAman等軟件分析，預(yù)測NcSRS2-NcGRA7復(fù)合蛋白抗原指數(shù)較高，復(fù)合蛋白二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-折疊為主，三級結(jié)構(gòu)中兩種蛋白獨(dú)立折疊，并借助Linker互相連接，功能互不影響。
　　2、Nc

5、SRS2-NcGRA7復(fù)合基因核酸疫苗的構(gòu)建
　　重組克隆質(zhì)粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7與pVAX1真核表達(dá)載體同時(shí)進(jìn)行EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切后，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-NcSRS2-NcGRA7，將PCR鑒定和酶切鑒定正確的重組真核表達(dá)質(zhì)粒脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR、IFAT及Western blotting技術(shù)鑒定pVAX1-NcSRS2-NcGRA7重組質(zhì)粒在Vero細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)

6、果，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-NcSRS2-NcGRA7經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定正確，并能夠在Vero細(xì)胞中表達(dá)。擴(kuò)增、純化重組質(zhì)粒制備NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因核酸疫苗。
　　3、NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因重組腺病毒疫苗的構(gòu)建
　　重組克隆質(zhì)粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7經(jīng)EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切后，亞克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭載體pCR259中，構(gòu)建pCR259-NcSRS2-NcG

7、RA7重組腺病毒穿梭質(zhì)粒，將PCR鑒定和酶切鑒定正確的pCR259-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒穿梭質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)化HighQ-1 Transpose-Ad294和HighQ-1感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行同源重組與純化，構(gòu)建NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒，PacⅠ酶切線性化后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染QBI-HEK293細(xì)胞包裝Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒。結(jié)果，經(jīng)PCR檢測，構(gòu)建的重組腺病毒含有NcSRS2-NcGR

8、A7復(fù)合基因；經(jīng)IFAT和Western blotting檢測，NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因在QBI-HEK293細(xì)胞中獲得表達(dá)。測得Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒滴度為109 TCID50/mL。
　　4、NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因疫苗的Prime-Boost免疫策略研究
　　80只BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組20只，分別為Prime-Boost免疫策略組（核酸疫苗初免，重組腺病毒疫苗二免

9、、三免）、Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組及PBS對照組。每隔2W肌肉注射接種一次，共接種3次，每次免疫前及三免后2W、4W、6W分別斷尾采血（三免2W后攻蟲小鼠除外），分離血清。ELISA測定IgG、IgG1、IgG2a抗體水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測三免2W后每組5只BALB/c小鼠的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群變化；ELISA試劑盒檢測細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、T

10、NF-α水平，以及血清中NO濃度。結(jié)果：
　　抗體水平：三免后,IgG OD410值 Prime-Boost免疫策略組顯著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組（p<0.05）、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組（p<0.01）及PBS對照組（p<0.01）；IgG1濃度Prime-Boost免疫策略組與Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組比較，差異不顯著（p>0.05），而與pVAX1

11、-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組及PBS對照組比較，差異顯著（p<0.05）；IgG2a濃度Prime-Boost免疫策略組顯著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組（p<0.05）、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組（p<0.01）及PBS對照組（p<0.01）。
　　T淋巴細(xì)胞亞群變化：三免2W后,CD4+ T細(xì)胞數(shù)量Prime-Boost免疫策略組與Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺

12、病毒疫苗組、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組比較，差異顯著（p<0.05）,而與PBS對照組比較，差異極顯著（p<0.01）；CD8+T細(xì)胞數(shù)量Prime-Boost免疫策略組與Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組比較，差異不顯著（P>0.05）,與PBS對照組比較，差異顯著（p<0.05）；CD4+/CD8+比值 Prime-Boost免疫策略組與Ad5-

13、NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組比較，差異顯著（p<0.05），而與pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組及PBS對照組比較，差異極顯著（p<0.01）。
　　細(xì)胞因子水平：三免后,IFN-γ濃度 Prime-Boost免疫策略組顯著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組（p<0.05）、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組（p<0.01）及PBS對照組（p<0.01）；IL-4濃度

14、Prime-Boost免疫策略組顯著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組（p<0.05）、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組（p<0.05）及PBS對照組（p<0.01）；TNF-α濃度Prime-Boost免疫策略組與Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組比較，差異不顯著（p>0.05），而與pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組及PBS對照組比較，差異顯著（p<0.05）。

15、>　　血清中 NO濃度：三免后,NO濃度 Prime-Boost免疫策略組略高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組，差異不顯著（p>0.05），與pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組比較，差異顯著（p<0.05）,與PBS對照組比較，差異極顯著（p<0.01）。
　　5、NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因疫苗的免疫保護(hù)性評價(jià)
　　三免2W后，每個(gè)試驗(yàn)組各取10只BABL/c小鼠，每只腹腔攻擊犬新孢

16、子蟲速殖子106個(gè)，攻蟲后觀察小鼠的臨床癥狀并統(tǒng)計(jì)存活率；攻蟲4W后，脫頸處死存活的BABL/c小鼠，病理解剖學(xué)觀察各主要臟器的外觀變化，病理組織學(xué)H.E染色和免疫組織化學(xué)觀察腦組織、肝、脾等臟器的病理組織學(xué)變化及蟲體定位，PCR方法檢測腦組織、肝、脾等臟器中犬新孢子蟲Nc-5基因。結(jié)果，攻蟲4W后的BALB/c小鼠，Prime-Boost免疫策略組和Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組的存活率均為100%，未出現(xiàn)明顯臨床

17、癥狀，主要器官組織均無明顯病理變化和蟲體存在，PCR檢測各器官組織中犬新孢子蟲Nc-5基因均為陰性；pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組的存活率為60%，攻蟲后第7d出現(xiàn)精神沉郁、后肢麻痹等臨床癥狀，主要器官組織以泛發(fā)型充血、出血為特征，腦、肝、脾組織中發(fā)現(xiàn)犬新孢子蟲包囊或速殖子，PCR檢測心、肝、脾、肺及腦組織中犬新孢子蟲Nc-5基因陽性；而PBS對照組的存活率為20%，攻蟲后第3d出現(xiàn)聳毛、怠惰、四肢癱瘓等臨床癥狀，各器

18、官組織以泛發(fā)型充血、出血為特征，腦、肝、脾組織中發(fā)現(xiàn)犬新孢子蟲速殖子，PCR檢測心、肝、脾、肺、腎及腦組織中犬新孢子蟲Nc-5基因陽性。綜合各試驗(yàn)組BALB/c小鼠免疫后產(chǎn)生的抗體、細(xì)胞因子等水平以及攻蟲后的整體變化評價(jià)，四個(gè)試驗(yàn)組中Prime-Boost免疫策略組優(yōu)勢顯著，該策略適用于新孢子蟲病的防控。
　　結(jié)論：
　　1、應(yīng)用SOE-PCR技術(shù)成功拼接了NcSRS2和NcGRA7基因，拼接復(fù)合基因的大小為1482 bp，

19、并對NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析。
　　2、構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-NcSRS2-NcGRA7，該質(zhì)粒能夠轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞獲得表達(dá)，并制備了pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗。
　　3、成功構(gòu)建了滴度為109 TCID50/mL的Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒，并制備了Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗。
　　4、建立的Prime-Boo