草魚(yú)出血病病毒vp6核酸疫苗和亞單位疫苗的免疫效果研究.pdf

1、草魚(yú)出血病病毒(Grass carp reovirus，GCRV)是水生呼腸孤病毒屬中致病力最強(qiáng)雙鏈RNA(dsRNA)病毒，因曾引起中國(guó)西南的85％草魚(yú)幼魚(yú)發(fā)生草魚(yú)出血病而被首次發(fā)現(xiàn)。目前的疫苗包括滅活疫苗和減毒疫苗，滅活疫苗不能進(jìn)入主要組織相容性復(fù)合體I(MHCI)類(lèi)抗原呈遞途徑，不能有效的誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)反應(yīng)，因此，免疫效果相對(duì)不理想、免疫力持久性差；減毒疫苗生產(chǎn)成本高，有毒力返祖現(xiàn)象，安全性較差，有回復(fù)致病性的潛在危

2、險(xiǎn)。魚(yú)體免疫接種的常規(guī)方法是浸泡免疫和注射免疫，浸泡免疫方法操作簡(jiǎn)單，但需要大量的疫苗；但注射免疫要求魚(yú)體要有一定的規(guī)格，操作強(qiáng)度大、技術(shù)要求高、技術(shù)推廣困難，而且魚(yú)的捕撈過(guò)程及注射對(duì)魚(yú)體均造成較大損傷。因此，生產(chǎn)上急需開(kāi)發(fā)安全可靠、高效多價(jià)、使用簡(jiǎn)便的草魚(yú)出血病口服亞單位/DNA聯(lián)合疫苗。
　　 1.草魚(yú)出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果評(píng)估
　　 為了評(píng)估草魚(yú)出血病病毒(GCRV) vp6基因核酸疫苗的免疫效果，將v

3、p6基因克隆進(jìn)pFastBacTMDual載體桿狀病毒多角體蛋白(Polh)啟動(dòng)子下游，同時(shí)將團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子控制的vp6基因克隆進(jìn)桿狀病毒P10啟動(dòng)子下游獲核酸疫苗載體pFastBac-FA-VP6-ph-VP6。按每尾分別注射疫苗載體10、30、60μg免疫草魚(yú)（體長(zhǎng)14～20 cm，體重60～120 g），同設(shè)pFastBacTMDual載體(30μg/尾)陰性對(duì)照組及

4、空白對(duì)照組(0.4 ml/尾無(wú)菌水)。于免疫后不同時(shí)間通過(guò)RT-PCR檢測(cè)免疫魚(yú)體中vp6基因的表達(dá)，并于免疫后第14、21、28、49、70 d分別通過(guò)間接凝集反應(yīng)檢測(cè)血液中的抗體水平和在免疫第21 d感染GCRV評(píng)估免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，核酸疫苗免疫草魚(yú)后，各免疫組均有抗體產(chǎn)生，抗體效價(jià)在免疫后第28 d達(dá)到最高;攻毒后每尾注射疫苗載體10、30、60μg組的死亡率分別為0％、0％、5％， pFastBacTMDual載體對(duì)照組和

5、空白對(duì)照組分別為30％和100％。表明構(gòu)建的核酸疫苗對(duì)草魚(yú)病毒性出血病有較好的免疫保護(hù)效果。
　　 2.原核表達(dá)GCRV VP6蛋白對(duì)草魚(yú)出血病的免疫保護(hù)作用
　　 為了探討草魚(yú)出血病病毒(GCRV)VP6亞單位疫苗對(duì)草魚(yú)出血病的免疫保護(hù)作用，將vp6基因克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pET-28a(+)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western blotting顯示，重組VP6蛋白的分子量約為43

6、 kDa，主要以包涵體形式存在，重組蛋白占菌體總蛋白的20％左右；Ni2+柱純化后的重組蛋白，以每尾500μg肌肉注射免疫草魚(yú)(14～20 cm，60～120 g)，并在第14、21、28、49、70 d通過(guò)間接凝集反應(yīng)檢測(cè)抗體水平，結(jié)果顯示，免疫注射后第14d可檢測(cè)到魚(yú)體產(chǎn)生的特異性抗體，第21d達(dá)到最高峰，第70 d仍可檢測(cè)到抗體的存在；免疫注射第21 d人工接種GCRV，免疫后的草魚(yú)對(duì)出血病的保護(hù)力達(dá)100％。研究結(jié)果為草魚(yú)出血病

7、亞單位疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.GCRV VP6蛋白亞單位/DNA聯(lián)合口服疫苗及免疫效果評(píng)價(jià)
　　 桿狀病毒具有高效表達(dá)外源基因以及安全有效向脊椎動(dòng)物細(xì)胞傳遞基因的功能，為了研發(fā)安全可靠、高效多價(jià)、使用方便的VP6蛋白亞單位/DNA聯(lián)合口服疫苗，本研究分別用團(tuán)頭魴的β-actin啟動(dòng)子和家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的多角體蛋白啟動(dòng)子控制GCRV vp6基因構(gòu)建供體質(zhì)spFastBac-FA-VP6-ph-VP

8、6，通過(guò)Bac to Bac系統(tǒng)獲重組桿狀病毒BacFish-VP6。重組病毒感染5齡家蠶后，采集血液，SDS-PAGE和Western blotting顯示，重組VP6蛋白的分子量約為53 kDa。重組病毒感染蠶蛹120h后，VP6蛋白的表達(dá)水平達(dá)到最高值，達(dá)血淋巴總蛋白的5％左右，冷凍干燥制成凍干粉，然后分別以1％、5％、10％的比例摻入飼料中（含2.5％淀粉），口服免疫草魚(yú)，通過(guò)間接凝集反應(yīng)檢測(cè)抗體水平，結(jié)果顯示，抗體產(chǎn)生水平呈劑

9、量依賴的方式，并在免疫后第3～4周抗體水平達(dá)到最高，至3個(gè)月后仍能檢測(cè)到特異性抗體的存在；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在口服免疫的魚(yú)血液中可特異性地檢測(cè)到vp6基因的mRNA，免疫組化法在免疫魚(yú)的肝、腎組織中可檢測(cè)到VP6蛋白，表明用感染重組桿狀病毒BacFish-vp6的蠶蛹凍干粉口服免疫，重組桿狀病毒BacFish-vp6能進(jìn)入魚(yú)體，并正確表達(dá)VP6蛋白，刺激魚(yú)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。初步的研究結(jié)果表明，表達(dá)VP6蛋白的蠶蛹凍干粉具有蛋白亞單