輪狀病毒LLR減毒活疫苗對SPF兔和無菌兔的致病性和免疫原性研究及其VP6基因的表達.pdf

1、輪狀病毒(RotavirusRV)是引起兒童重癥腹瀉的最常見病原之一。據(jù)估計，僅2004年輪狀病毒感染引起約527000死亡病例，主要發(fā)生在發(fā)展中國家。嚴(yán)重地威脅到兒童的健康，由于目前尚無治療輪狀病毒的特效藥，因此預(yù)防尤為重要。當(dāng)前全球范圍內(nèi)批準(zhǔn)上市的疫苗有三種：單價人減毒活疫苗(Rotarix)、五價牛-人重配株疫苗(RotaTeq)和單價羊株減毒活疫苗(LLR)。然而，因大多數(shù)輪狀病毒疫苗是不同重配疫苗株混合而成的多價疫苗，因此，其

2、研制、生產(chǎn)和臨床評價中各型毒株的特異性體內(nèi)外定量和定性檢測是疫苗質(zhì)量控制的關(guān)鍵。本文運用SPF兔和無菌兔來研究輪狀病毒疫苗免疫和感染情況，為新型輪狀病毒疫苗的臨床評價奠定基礎(chǔ)。 第一部分：輪狀病毒LLR減毒活疫苗對SPF兔和無菌兔的致病性和免疫原性研究第一部分實驗選用SPF級兔和無菌兔為動物模型，通過免疫接種單價羊株輪狀病毒減毒活疫苗，研究檢測免疫前后有關(guān)指標(biāo)的變化：用ELISA檢測血清中IgA和IgG的變化來評價接種疫苗后動物

3、的體液免疫；用流式細(xì)胞儀檢測外周血CD4/CD8比值的變異來研究接種疫苗后動物細(xì)胞免疫的變化；通過檢測動物的便樣，觀察是否出現(xiàn)腹瀉癥狀和排出病毒和通過免疫組化觀察小腸中是否有輪狀病毒來闡明LLR是否在小腸繁殖-感染小腸。結(jié)果表明：LLR疫苗可以誘導(dǎo)SPF和無菌兔產(chǎn)生包括體液免疫和細(xì)胞免疫在內(nèi)的RV特異性免疫應(yīng)答；可在小腸復(fù)制但不致病。 第二部分：輪狀病毒VP6基因的表達第二部分實驗研究了羊株輪狀病毒VP6基因在大腸桿菌中的表達。

4、通過用Trizol法從羊株輪狀病毒減毒活疫苗中提取RNA病毒，RT-PCR擴增輪狀病毒第6節(jié)段基因全長，與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆。將重組質(zhì)粒進行PCR擴增VP6基因，再與載體pET-32a連接構(gòu)建pET-32a-vp6表達載體，測序結(jié)果正確，VP6基因在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達，Western-blot鑒定證明了表達產(chǎn)物為RVVP6蛋白。獲得的VP6蛋白抗原用于制備檢測血清中輪狀病毒IgA的ELISA試劑