小麥抗蚜蟲基因PPA的花粉管通道法轉化.pdf

1、小麥是世界總產量第二的糧食作物，病蟲害是造成小麥減產及糧食品質下降的重要原因。每年全球糧食總產量因蟲害造成的損失超過10％。因此，有效的防治糧食作物的害蟲，是糧食增收的重要途徑。在農業(yè)生產中，小麥蚜蟲主要還是采用農藥防治的方法。噴灑農藥不但增加生產成本還嚴重影響環(huán)境、破壞生態(tài)平衡。
　　 本課題主要分為三個實驗階段:第一階段將掌葉半夏中的抗蚜蟲基因PPA構建到植物雙元表達載體pCAMBIA1380上并將該質粒儲存在大腸桿菌DH5

2、α菌株中。載體構建時，先用PCR儀分別擴增載體pCAMBIA1380上的CAMV35S啟動子、PBl122上的PPA基因和PTCK303上的GUS報告基因再將三種擴增產物分別與T載體連接并酶切、測序鑒定，鑒定成功后，再利用酶切、回收等方法將這三段基因從T載體上切下連到表達載體pCAMBIA1380上;第二階段是從大腸桿菌中提取出合適濃度和用量的構建好的質粒并做PCR鑒定，鑒定為陽性后，在合適的時間用花粉管通道法將其轉入小麥細胞中。轉化后

3、的小麥需與其它小麥品種隔離，細心培養(yǎng)直至結出T1代種子，再將T1代種子種下培養(yǎng)后代轉基因植株;第三階段則是鑒定出轉化成功的陽性植株并做匯總分析以及驗證陽性植株的抗蟲效果。
　　 實驗結果表明:花粉管通道法轉化后產生的T1、T2代小麥細胞中還有質粒存在，PCR鑒定結果大部分為假陽性，隨著細胞的分裂與分化，T3代植株中的質粒已經徹底消失，最后鑒定得到的陽性植株基因組中真正整合了PPA基因。而放蟲實驗一方面驗證了PPA基因抗蚜功能的有