利用花粉管通道法將輪狀病毒VP7基因轉(zhuǎn)化番木瓜的研究.pdf

1、本研究將攜帶VP7基因的pBIVP7質(zhì)粒酶切，去除NptⅡ基因片段，獲得線性化無選擇標記載體MFpBIVP7-1和MFpBIVP7-2。通過花粉管通道法，將pBIVP7質(zhì)粒DNA和MFpBIVP7-1和MFpBIVP7-2載體DNA(均攜帶組成型啟動子CaMV35S)導(dǎo)入番木瓜。采用正交試驗觀察導(dǎo)入外源DNA類型、DNA濃度、DNA注入時間三因子對番木瓜花粉管通道法轉(zhuǎn)基因在座果率、成株率、轉(zhuǎn)化率的影響，并對轉(zhuǎn)基因植株進行VP7基因、NP

2、TⅡ基因的PCR檢測和RT-PCR、Westernblot、ELISA等一系列分子生物學鑒定。結(jié)果表明： 1)綜合考慮外源DNA類型、DNA濃度、DNA注入時間在番木瓜花粉管通道法遺傳轉(zhuǎn)化上對坐果率、成株率和轉(zhuǎn)化率三方面的影響，DNA類型、DNA濃度、DNA注入時間的最佳組合是：DNA類型選擇線狀DNA，DNA片段大小在保證帶有完整目的基因DNA片段、DNA供體性狀能夠表達的前提下，選擇10Kb以下的小DNA片段；DNA注入時間

3、選擇在授粉后第5天；DNA濃度控制在1000μg/ml。坐果率、成株率、轉(zhuǎn)化率可達一個最佳綜合水平。 2)通過花粉管通道法成功將pBIVP7載體、MFpBIVP7-1載體、MFpBIVP7-2載體轉(zhuǎn)化番木瓜。 3)對所獲得的269株轉(zhuǎn)化植株進行VP7基因的PCR檢測，獲得21株陽性株。這21株陽性株經(jīng)朋NPTⅡ基因的PCR檢測，pBIVP7轉(zhuǎn)化植株中有2株的NptⅡ基因、VP7基因同時獲得轉(zhuǎn)化，1株表現(xiàn)為轉(zhuǎn)化分離。8株M

4、FpBIVP7-1轉(zhuǎn)化植株、10株MFpBIVP7-2轉(zhuǎn)化植株檢測到VP7基因、未檢測到朋NPTⅡ基因。 4)對21株VP7基因PCR檢測陽性植株進行RT-PCR分析，有3株pBIVP7轉(zhuǎn)基因植株，6株MFpBIVP7-1轉(zhuǎn)基因植株和7株MFpBIVPT-2轉(zhuǎn)基因植株擴增出特異性條帶，2株MFpBIVP7-1轉(zhuǎn)基因植株和3株MFpBIVP7-2轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)入的VP7基因不能正常轉(zhuǎn)錄，發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默。 在RTPCR

5、陽性株中選長勢良好的2株轉(zhuǎn)pBIVP7植株、4株轉(zhuǎn)MFpBIVP7-1植株和5株轉(zhuǎn)MFpBIVP7-2植株經(jīng)Westernblot和ELISA等分子生物學鑒定，確定VP7基因已轉(zhuǎn)入番木瓜基因組，并得到正確表達。5號的MFpBIVP7-1轉(zhuǎn)基因番木瓜目的蛋白的表達量最高，活性VP7蛋白占可溶性蛋白的含量為1.74‰，9號的MFpBIVP7-2轉(zhuǎn)基因番木瓜的目的蛋白表達量排第2，活性VP7蛋白占可溶性蛋白的含量為1.20‰。 5)獲