四氫嘧啶羥化酶的表達純化及其結(jié)構(gòu)解析.pdf

1、四氫嘧啶及5-羥基四氫嘧啶在精細化工、生物醫(yī)藥、生物制造及生產(chǎn)、環(huán)保等領(lǐng)域有廣泛的用途及應(yīng)用前景。四氫嘧啶羥化酶能以Fe2+為輔因子、α-酮戊二酸為輔底物，催化四氫嘧啶轉(zhuǎn)化為5-羥基四氫嘧啶，是微生物發(fā)酵生產(chǎn)5-羥基四氫嘧啶過程中的關(guān)鍵酶。蛋白質(zhì)晶體學(xué)利用X射線衍射技術(shù)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行解析，使我們從原子角度了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合蛋白質(zhì)的功能特性，確定在實際催化過程中的功能基團及其作用方式，為定向改造提供重要信息。
　　本文以

2、Bacillus pseudofirmus OF4菌株中的四氫嘧啶羥化酶EctD為研究對象，從其表達、純化以及結(jié)晶等方面展開深入研究。利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒EctD-pET-22b(+)，并在E.coli BL21(DE3)實現(xiàn)了高效可溶性表達，經(jīng)Ni-NTA親和層析、SuperdexTM20010/300 GL分子篩層析、Resource Q離子交換層析純化過程后，得到純度大于95％的目的蛋白。利用商業(yè)結(jié)晶試劑盒通過懸

3、滴和坐滴氣象擴散法對目的蛋白的結(jié)晶條件進行篩選。通過進一步結(jié)晶條件優(yōu)化，在0.2 mol/L MgCl2，0.1mol/L BIS-TRIS(pH6.5)，25％(g/mL) PEG3，350，目的蛋白濃度為6.5 mg/ml結(jié)晶條件，運用坐滴氣象擴散法下獲得了高分辨率的目的蛋白晶體樣本。最終收集到分辨率為2.40(A)的EctD晶體的衍射數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)處理結(jié)果顯示:EctD晶體屬于三斜晶系，空間群為P1晶胞參數(shù)為a=45.183(A)，b

4、=58.871(A)，c=68.812(A)，α=77.478°，β=86.034°，γ=66.966°。采用原子置換法(MR)，成功解析了EctD的三維結(jié)構(gòu)。一個晶胞由兩個蛋白質(zhì)分子組成，每個單體由9個α螺旋和9個β折疊通過轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和loop結(jié)構(gòu)鏈接形成。EctD晶體結(jié)構(gòu)的解析為我們深入理解四氫嘧啶羥化酶的酶結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能提供重要的指導(dǎo)信息。
　　另外，針對該蛋白與輔底物α-酮戊二酸及底物四氫嘧啶的復(fù)合物結(jié)晶工作在進一步進行中