苯酚羥化酶基因工程菌合成靛藍(lán)及其同系物的特性研究.pdf

1、靛藍(lán)作為古老色素，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、印染、食品等行業(yè)。微生物法合成靛藍(lán)因其綠色安全、高效、高選擇性等特點逐漸受到人們的關(guān)注，但其工業(yè)化進(jìn)程十分緩慢。因此，開發(fā)新型高效合成靛藍(lán)的酶資源，優(yōu)化其合成條件，考察其對靛藍(lán)同系物的合成情況，并對其合成機(jī)理進(jìn)行探討對微生物合成靛藍(lán)的深入研究具有重要意義。
　　本論文以實驗室前期構(gòu)建的苯酚羥化酶基因工程菌(PH_IND)為研究對象。首先，對苯酚羥化酶的基因序列進(jìn)行分析，并考察其粗酶特性;其次，優(yōu)化

2、該基因工程菌轉(zhuǎn)化吲哚合成靛藍(lán)的轉(zhuǎn)化條件，鑒定其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，推測其轉(zhuǎn)化的代謝途徑;最后，考察該基因工程菌轉(zhuǎn)化吲哚同系物合成靛藍(lán)類色素的特性，并對合成的色素進(jìn)行鑒定。
　　氨基酸序列分析表明苯酚羥化酶含有KLMNOP六個組分，與已知相應(yīng)組分的序列最高同源性為51-87％，表明該苯酚羥化酶具有一定新穎性。利用表面響應(yīng)法優(yōu)化苯酚羥化酶基因工程菌(PH_IND)的最優(yōu)生長條件及表達(dá)條件為種齡7.19h、接種量1.39％、誘導(dǎo)OD6000.54

3、、IPTG濃度0.19 mmol/L、誘導(dǎo)時間2.37 h、誘導(dǎo)溫度35℃，此時，苯酚羥化酶的最大酶活力為0.6167 U/mg。粗酶特性表明:苯酚羥化酶的最適反應(yīng)pH值為8.0，最適反應(yīng)溫度為40℃，具有一定濃度的NaCl耐受能力。
　　苯酚羥化酶基因工程菌(PH_IND)合成靛藍(lán)的最佳條件為菌體濃度為OD6002.5，吲哚濃度200 mg/L，反應(yīng)時間6h，在此條件下靛藍(lán)的最大生成量為92.5 mg/L。利用HPLC-MS和N

4、MR對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，分別為靛藍(lán)、靛玉紅及2-(7-oxo-1H-indol-6(7H)-ylidene) indolin-3-one，并推測出該基因工程菌轉(zhuǎn)化吲哚合成靛藍(lán)的途徑，首次報道靛紅和7-羥基吲哚在C-2和C-6位聚合生成2-(7-oxo-1H-indol-6(7H)-ylidene) indolin-3-one途徑。
　　分子對接模擬和該基因工程菌(PH_IND)合成靛藍(lán)類色素的廣譜性研究都表明除3-甲基吲哚外，該基