抗凍蛋白TmAFP84a二體和三體的構(gòu)建及表達(dá)分析.pdf

1、抗凍蛋白具有熱滯活性，但生物體內(nèi)的天然抗凍蛋白活性很難滿足諸多方面應(yīng)用。因此，探索出生產(chǎn)高活性抗凍蛋白的有效方法亟待解決。本研究基于此目的利用基因工程的技術(shù)和方法開展了抗凍蛋白基因的分子改造和表達(dá)工作。以黃粉甲AFP84a為材料，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在體外人工構(gòu)造了AFP84a二體和三體的目的DNA片段。將兩段目的基因與載體pMAL-p2X雙酶切后連接，構(gòu)建了兩個(gè)分泌融合表達(dá)質(zhì)粒；表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli TBI后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

2、，目的蛋白表現(xiàn)為可溶性。MgSo<,4>溶解法與超聲波細(xì)胞破碎法均能使目的蛋白從細(xì)胞中釋放，MgSo<,4>的合適濃度為0.05 mmol/L。運(yùn)用親和層析和分子篩層析純化后，SDS-PAGE顯示目的蛋白呈單一條帶，生物活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白具有一定的抗凍活性。 使用生物信息學(xué)方法對(duì)目前已經(jīng)研究過的抗凍蛋白進(jìn)行綜合分析，從GenBank中搜索不同物種中的抗凍蛋白基因進(jìn)行比較分析，并構(gòu)建了它們的同源進(jìn)化樹。此外，還運(yùn)用電子克隆的手