P-糖蛋白在健康和大腸桿菌感染肉雞組織中的表達(dá)差異及其對(duì)口服恩諾沙星藥動(dòng)學(xué)的影響.pdf

1、P-gp是由Abcb1基因編碼的一種相對(duì)分子質(zhì)量為170 kda的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于能量依賴的藥物外排泵。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，P-gp除了在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)介導(dǎo)其對(duì)化療藥物的耐藥外，人和動(dòng)物的正常組織中也有分布，如膽小管、腸上皮、腎小管以及血腦屏障等，可限制藥物及其它外源性物質(zhì)在生物體內(nèi)的吸收、分布和排泄，是影響口服藥物生物利用度的一個(gè)重要因素。P-gp的表達(dá)可以受到多種因素影響，包括化學(xué)物質(zhì)、年齡、性別、生理狀態(tài)、疾病以及激素等。目前關(guān)

2、于大腸桿菌感染對(duì)肉雞體內(nèi)P-gp表達(dá)和功能的影響以及對(duì)口服底物藥物藥動(dòng)學(xué)過程的研究仍較少，故本試驗(yàn)研究了大腸桿菌感染對(duì)肉雞P-gp mRNA表達(dá)的影響及其對(duì)恩諾沙星在肉雞體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響，并初步探討了大腸桿菌對(duì)P-gp mRNA表達(dá)影響的調(diào)控機(jī)制。
　　首先，采用P-gp誘導(dǎo)劑利福平以及抑制劑維拉帕米研究其對(duì)恩諾沙星在肉雞體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響，證實(shí)恩諾沙星為P-gp的底物。本研究選取30只健康8周齡肉雞，隨機(jī)分為6組(n=5)，分別為

3、單劑量口服恩諾沙星(10 mg/kg.bw)組、單劑量口服維拉帕米(15 mg/kg.bw)后口服恩諾沙星(10 mg/kg.bw)組、單劑量口服利福平(500mg/只)后口服恩諾沙星（10 mg/kg.bw）組、單劑量靜注恩諾沙星(10 mg/kg.bw)組、單劑量口服維拉帕米后靜注恩諾沙星(10 mg/kg.bw)組以及單劑量口服利福平(500mg/只)后靜注恩諾沙星(10 mg/kg.bw)組。給藥后在不同時(shí)間點(diǎn)采血，采用HPLC

4、法測(cè)定血漿中恩諾沙星的藥物濃度。結(jié)果顯示:恩諾沙星的吸收速率常數(shù)Ka為1.38±0.31 h-1，達(dá)峰時(shí)間Tmax為1.78±0.18 h，血漿中峰濃度Cmax為1.97±0.24μg/mL，藥時(shí)曲線下面積AUC0-∞為14.54±1.03(μg/mL)*h。給予P-gp抑制劑維拉帕米后，口服恩諾沙星的峰濃度Cmax上升為2.3±0.37μg/mL(P=0.459)，藥時(shí)曲線下面積AUC0-∞極顯著上升為24.63±1.85(μg/mL

5、)*h(P=0.001)，達(dá)峰時(shí)間Tmax顯著提前為1.11±0.14 h（P=0.026），吸收速率Ka極顯著上升為2.98±0.29h-1（P=0.008），生物利用度增加了1.62倍，但維拉帕米對(duì)靜脈注射恩諾沙星的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)影響并不顯著;給予P-gp誘導(dǎo)劑利福平后，口服恩諾沙星的峰濃度Cmax極顯著下降為0.45±0.06μg/mL(P=0.002)，達(dá)峰時(shí)間Tmax延遲至5.32±1.15 h（P=0.011），藥時(shí)曲線下面積A

6、UC0-∞顯著降低為8.37±2.36(μg/mL)*h（P=0.036），吸收速率Ka顯著降低為0.38±0.1 h-1(P=0.029)，生物利用度下降1.64倍，同樣其對(duì)靜脈注射的恩諾沙星藥動(dòng)學(xué)參數(shù)并未產(chǎn)生顯著影響。結(jié)果表明P-gp活性被調(diào)節(jié)后對(duì)肉雞體內(nèi)恩諾沙星的口服吸收過程會(huì)產(chǎn)生顯著影響，證實(shí)恩諾沙星為P-gp底物。
　　基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本論文進(jìn)一步研究了大腸桿菌感染對(duì)肉雞組織中P-gp的功能和表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)選取10只

7、4周齡健康肉雞，隨機(jī)分為健康組和大腸桿菌感染組。處死后，采集肝臟、腎臟、十二指腸、空腸和回腸置于液氮中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。提取總RNA，反轉(zhuǎn)后，對(duì)Abcb1進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定。結(jié)果顯示，與健康組相比，大腸桿菌感染之后Abcb1的表達(dá)量在各組織中都有所上調(diào)，其中在腎臟、空腸和回腸中差異顯著（P=0.032，P=0.017，P=0.046）。然后，我們采用免疫組化的方法，探究P-gp在健康和大腸桿菌感染肉雞肝臟、腎臟、十二指腸、空腸和回

8、腸的分布特點(diǎn)及表達(dá)差異。結(jié)果顯示，P-gp在肝臟主要定位于肝細(xì)胞之間的膽小管膜上，在腎臟主要定位于腎小管的細(xì)胞膜上，在小腸主要定位于小腸絨毛上皮細(xì)胞頂端。采用Imagepro-plus軟件進(jìn)行半定量分析，比較P-gp在健康組和感染組表達(dá)量的差異。結(jié)果顯示，感染之后P-gp在肝臟和腎臟細(xì)胞內(nèi)的定位量有所上升，但是在細(xì)胞膜上的定位減少。P-gp在十二指腸中的表達(dá)量幾乎沒有變化，在空腸和回腸中表達(dá)量顯著上升(P＜0.05)。最后，我們使用HP

9、LC檢測(cè)了大腸桿菌感染前后恩諾沙星血藥濃度的變化情況，同時(shí)檢測(cè)P-gp抑制劑維拉帕米對(duì)雞口服恩諾沙星的藥動(dòng)學(xué)影響。我們選用40只4周齡健康肉雞，隨機(jī)分為4組:(1)口服恩諾沙星健康組(2)口服恩諾沙星+維拉帕米(3)口服恩諾沙星感染組(4)口服恩諾沙星+維拉帕米感染組。結(jié)果表明，與健康組肉雞相比，感染會(huì)造成恩諾沙星的Cmax(P=0.000)和AUC0-12h(P=0.042)極顯著或顯著下降，Tmax顯著延長(zhǎng)（P=0.040），T1/

10、2a和T1/2e顯著升高(P=0.045，P=0.000)，揭示著恩諾沙星的吸收被抑制。而用維拉帕米處理后，健康組和感染組中恩諾沙星的口服吸收增加，表現(xiàn)為峰濃度和AUC0-12h均顯著上升，達(dá)峰時(shí)間提前。該結(jié)果提示大腸桿菌感染可以引起肉雞組織中P-gp表達(dá)變化，進(jìn)而影響口服恩諾沙星在肉雞體內(nèi)的吸收過程。
　　最后本論文初步探討了大腸桿菌感染對(duì)P-gp mRNA表達(dá)變化的調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)比較了健康和感染肉雞中細(xì)胞因子（IL-6、IL-

11、1β和TNFα）以及轉(zhuǎn)錄因子如核受體(CXR)、NF-κB的mRNA表達(dá)差異，并分析其與Abcb1 mRNA表達(dá)變化的相關(guān)性。結(jié)果顯示，感染之后，IL-6在各組織中都有所上升，其中在肝臟差異顯著（P=0.023）;IL-1β在各組織中均有顯著的上升（肝臟P=0.018，腎臟P=0.022，十二指腸P=0.000，空腸P=0.001，回腸P=0.002）;TNFα在各組織中均有上升，其中在腎臟、空腸和回腸差異顯著（P=0.01，P=0.0

12、00，P=0.001）;CXR在各組織中均有上升，其中在十二指腸、空腸和回腸差異顯著（P=0.002，P=0.008，P=0.017）;NF-κB在各組織中均有上升，其中在空腸和回腸差異顯著（P=0.021，P=0.044）。分析調(diào)控因子的表達(dá)量變化與Abcb1表達(dá)水平變化的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Abcb1的調(diào)控機(jī)制存在組織差異性，腎臟、空腸和回腸中Abcb1 mRNA表達(dá)的變化與CXR、TNFα/NF-κB通路呈顯著相關(guān)，可能受二者的共同調(diào)控，

13、另外空腸（r=0.813，P=0.000）和回腸（r=0.634，P=0.015）中Abcb1mRNA的表達(dá)量變化與IL-1β也呈顯著性相關(guān)。而IL-6與各組織中Abcb1表達(dá)量變化未呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。
　　綜上結(jié)果，大腸桿菌感染可導(dǎo)致肉雞組織中P-gp的表達(dá)上調(diào)，外排功能增強(qiáng)，可使恩諾沙星在腸道的吸收減少。大腸桿菌感染導(dǎo)致P-gp表達(dá)上調(diào)與核受體CXR、促炎性細(xì)胞因子TNFα、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的變化密切相關(guān)，但其具體的調(diào)控機(jī)