miRNA在初發(fā)Graves病調(diào)節(jié)性T細胞中差異表達及熒光標記miRNA與細胞非特異結(jié)合的研究.pdf

1、miRNA是一種長約22nt的非編碼小RNA分子，在幾乎所有生命活動和疾病的發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮關鍵作用。Graves病(GD)是一種最常見的自身免疫性疾病，而調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是免疫調(diào)控中的關鍵細胞。已有研究表明microRNA對自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有提示作用，但是microRNA在Graves病中的研究還很少，在Graves病患者外周血Treg細胞中的研究更少。另外，在研究microRNA的眾多方法中，熒光標記和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是最

2、常用的兩種方法.這兩種方法結(jié)合可以方便的改變細胞miRNA水平，并示蹤定位miRNA在細胞內(nèi)的位置，在miRNA的研究中發(fā)揮重要作用。然而，盡管已有大量脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染核酸機制的研究，但迄今為止對熒光素標記的miRNA分子在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過程中的特點、機制和特異性的研究仍然不多。
　　目的：
　　研究microRNA在初發(fā)Graves病Treg中的差異表達情況及作用，并探討microRNA在外周血Treg中研究較少的原因，以及針對其中

3、熒光標記的microRNA非特異性粘附在細胞膜表面的現(xiàn)象進行深入研究。
　　材料和方法：
　　我們收集45例初發(fā)Graves病患者和61例正常人外周血，用流式細胞儀分離出CD4+CD25highTreg細胞，比較Treg細胞比例和數(shù)目變化情況;再利用實時熒光定量(RT-PCR)方法從CD4+CD25highTreg細胞中篩選出表達有差異的microRNA;最后從差異表達的microRNAs中選出一個研究其在正常Treg中的功

4、能。另外，對于在研究過程中發(fā)現(xiàn)的Cy5熒光標記的microRNA在轉(zhuǎn)染過程中與細胞的非特異性結(jié)合這一現(xiàn)象，進一步利用不同熒光素（親水性的羧基熒光素FAM和疏水性的碳烯花菁類Cy5）標記的不同microRNA用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染不同細胞（懸浮細胞K562和貼壁細胞Hela），并用流式細胞儀和共聚焦顯微鏡等技術(shù)深入研究了在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中這種熒光標記miRNA與細胞之間非特異性粘附的普遍性及其可能機制。
　　結(jié)果：
　　初發(fā)Graves病患

5、者外周血CD4+CD25highTreg細胞占CD4+T細胞的比例和數(shù)目與正常人相比，沒有明顯差異。而且，單位體積外周血中CD4+CD25highTreg細胞含量很少。但是，PCR發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，miR28、miR363和miR191在初發(fā)Graves病患者外周血CD4+CD25highTreg中表達有差異，miR28和miR363高表達，miR191低表達。一些在CD4+CD25highTreg中含量很低的microRNA如miR

6、190、miR519e、miR374a等檢測不出。
　　流式細胞儀和共聚焦顯微鏡檢測顯示Cy5熒光標記的microRNA在利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CD4+T細胞過程中存在非常明顯的非特異性粘附。
　　非特異性粘附研究結(jié)果表明，在未加入脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的情況下，碳烯花菁類熒光染料Cy5標記的miRNA分子能與貼壁的Hela細胞和懸浮的K562細胞表面牢固結(jié)合;而羧基熒光染料FAM與K562細胞表面的結(jié)合也非常明顯，但與Hela細胞表面的結(jié)

7、合不明顯。加入轉(zhuǎn)染試劑后，由于貼壁細胞轉(zhuǎn)染效率較高，與細胞表而結(jié)合的大部分熒光標記miRNA分子都進入貼壁的Hela細胞內(nèi);而絕大部分熒光標記miRNA分子仍與懸浮的K562細胞表面結(jié)合，未進入細胞。而且，破壞靜電相互作用的高鹽buffer不影響上述熒光標記miRNA分子與不同細胞表面的非特異結(jié)合，但破壞疏水相互作用的有機溶劑可以消除它。這提示熒光標記的miRNA可能是通過疏水相互作用而與細胞表面非特異結(jié)合。
　　結(jié)論：
　

8、　這些結(jié)果提示，初發(fā)Graves病患者外周血CD4+CD25highTreg比例和數(shù)目沒有變化，但是Treg中存在部分microRNA差異表達現(xiàn)象，這些microRNA可能與Graves病患者體內(nèi)免疫失調(diào)有關。但是，外周血Treg細胞含量少，而且由于其本身原代懸浮的特性，使microRNA在Treg細胞中的功能研究受到技術(shù)限制。其中作為研究microRNA在細胞內(nèi)到底發(fā)揮何種作用時常用的熒光標記microRNA轉(zhuǎn)染細胞的技術(shù)存在熒光染料