MiRNA let-7與MMP-2在非小細胞肺癌中的表達及相關性研究.pdf

1、目的
　　 分析非小細胞肺癌中MicroRNA let-7與基質金屬蛋白酶2(MMP-2)的表達及臨床意義,探討其在非小細胞肺癌發(fā)生及發(fā)展中的作用及二者的相關性。
　　 材料與方法
　　 臨床病例資料收集:收集中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸外科2010年6月至2011年3月46例非小細胞肺癌患者手術切除的肺癌組織及其配對的癌旁組織(腫瘤遠端5cm以外或手術邊緣經(jīng)病理檢查未發(fā)現(xiàn)癌細胞),其中男性20例,女性26例,年齡

2、46-71歲,中位年齡58歲,平均62歲。鱗癌13例,腺癌33例。留取標本已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,并在每次采集標本前均由患者簽署知情同意書。
　　 免疫組織化學染色及結果判定:采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P法)檢測MMP-2蛋白的表達,以PBS代替一抗作為陰性對照組。結果判定:根據(jù)每張切片的陽性細胞比例及著色深淺計分,著色細胞比例1/3以下為1分:1/3-2/3為2分;2/3以上為3分。著色深度:無著色為0分;淺黃色

3、為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。然后根據(jù)二者乘積作為每一例的積分,積分＜4分為陰性;≥4分為陽性。
　　 蛋白免疫印跡及結果判定:收集組織(包括肺癌組織及配對的癌旁組織),勻漿,離心,Bradford比色法測定蛋白質濃度。12%SDS-PAGE電泳,恒定電壓100V下轉膜2小時,室溫封閉1小時。用TBST將MMP-2-抗稀釋至1:200,倒入已放好膜的孵育袋中4℃過夜。用TBST按1:10000配制二抗,室溫下孵育2小時,E

4、CL發(fā)光。測量灰度值,統(tǒng)計分析肺癌組和癌旁組織組中目的條帶灰度值與內參灰度值比值的差異性。
　　 實時定量PCR:收集組織(包括肺癌組織及配對的癌旁組織)使用試劑盒抽取總RNA,逆轉錄合成cDNA。采用反應體系包括SYBRPremixExTap12.50μl、引物各1μl、DNA模板20μl、ROXReferenceDye(50x)0.5μl、dH2O8μ1。反應條件為95℃,5S;60℃,30S;40個循環(huán)。U6和B-acti

5、n為內參照,運用2-△△CT法計算檢測let-7和MMP-2相對表達量。
　　 結果
　　 MMP-2免疫組化染色的陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒,為漿表達。MMP-2在46例肺鱗癌和腺癌中陽性表達為30例(65.2%),在癌旁組織為7例(15.2%),統(tǒng)計學結果顯示兩者比較具有統(tǒng)計學意義(x2=24.3,P＜0.001)。MMP-2的表達與腫瘤臨床分期及淋巴結轉移具有相關性(x2=4.28,P＜0.05;x=6.10,P＜0.0

6、5),而與病人的年齡、性別及病理分型統(tǒng)計學顯示無相關性。
　　 蛋白免疫印跡結果顯示,肺癌組織相對表達量為3511.2±692.4,癌旁組織的相對表達量為1437.2±382.5,肺癌組織中MMP-2蛋白的表達高于對應的癌旁組織(t=10.698,p＜0.001)。
　　 實時定量PCR示在46例肺鱗癌和腺癌中與配對的癌旁組織比較let-7低表達的為29例(63.0%),MMP-2高表達的為31例(67.4%)。統(tǒng)計學顯

7、示let-7和MMP-2在非小細胞肺癌和癌旁組織中的差異性表達具有統(tǒng)計學意義。在46例NSCLC組織中,let-7與MMP-2蛋白表達呈負相關(P＜0.05,rs=-0.433)。
　　 結論
　　 MMP-2及Let-7在肺癌中的表達存在異常,提示二者可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展的過程。MMP-2的異常表達與淋巴結轉移及臨床病理分期相關,提示MMP-2在肺癌的發(fā)展中有一定促進作用。Let-7的低表達可能引起MMP-2表達的