同型半胱氨酸調(diào)控MLCK影響實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸粘膜通透性的作用研究.pdf

1、背景：炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease, IBD）是一種目前發(fā)病機(jī)制尚不十分明確的慢性腸道炎癥性疾病。既往研究表明，腸道粘膜緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞引起腸粘膜通透性增加對(duì) IBD的發(fā)病過(guò)程具有重要影響。同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）是一種含硫氨基酸，是甲硫氨酸代謝的重要中間產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)Hcy可能通過(guò)多種途徑影響內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能，提高內(nèi)皮細(xì)胞通透性，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。炎癥性腸?。↖BD）患者血漿

2、和結(jié)腸粘膜組織中Hcy水平增高，但Hcy是否通過(guò)影響腸上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)及功能，進(jìn)一步影響腸粘膜通透性參與IBD的病理生理過(guò)程尚不明確。因此，本研究擬在建立大鼠TNBS/乙醇結(jié)腸炎模型及人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株的基礎(chǔ)上，探討同型半胱氨酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸粘膜通透性及Caco-2細(xì)胞單層通透性的影響及其作用機(jī)理。
　　目的：探討同型半胱氨酸（Hcy）對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠小腸粘膜通透性及Caco-2細(xì)胞單層通透性的影響及作用機(jī)理。

3、r>　　方法：1. Caco-2細(xì)胞經(jīng)Hcy預(yù)處理不同信號(hào)通路抑制劑（ERK抑制劑 PD98059, P38MAPK抑制劑 SB203580, Rho抑制劑 Y27632, Ca2+/Calmodulin抑制劑 KN62, PKC抑制劑 Staurosporine以及 MLCK抑制劑 ML-7）之后，加入 FITC。記錄Caco-2細(xì)胞TEER隨時(shí)間變化情況，同時(shí)于 lower chamber取樣，樣品中 FITC濃度通過(guò)熒光分光光度計(jì)

4、測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集細(xì)胞懸液，Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中 MEK，ERK，p-ERK, MLCK, p-MLCK, ZO-1, Claudin-1, Claudin-2, Occludin蛋白表達(dá)。2.使用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇灌腸制備實(shí)驗(yàn)性大鼠結(jié)腸炎模型，采用皮下注射同型半胱氨酸造成高同型半胱氨酸血癥（HHcy）模型。3. SD雄性大鼠，分成4組：A組為對(duì)照組（NS注射+NS灌腸），B組為對(duì)照+Hcy注

5、射組（Hcy注射+NS灌腸），C組為TNBS模型組（NS注射+TNBS/乙醇灌腸），D組為TNBS模型+Hcy注射組（Hcy皮注射+TNBS/乙醇灌腸）。4.記錄觀察大鼠每日體重變化及糞便情況，根據(jù)大鼠癥狀及體重變化情況進(jìn)行疾病活動(dòng)性評(píng)分（DAI），切取實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸標(biāo)本行HE染色，并行結(jié)腸組織學(xué)損傷評(píng)分（HI）5.大鼠結(jié)腸Hcy及MLCK水平通過(guò)ELISA方法檢測(cè)，大鼠結(jié)腸MPO活性通過(guò)四甲基聯(lián)苯胺法測(cè)定，大鼠小腸粘膜組織中 M

6、EK，ERK，p-ERK, MLCK, p-MLCK, ZO-1, Claudin-1, Claudin-2, Occludin蛋白表達(dá)使用免疫組化及western blot方法測(cè)定，MLCK mRNA表達(dá)通過(guò)RT-qPCR方法檢測(cè)。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，Caco-2細(xì)胞使用50μmol/L Hcy預(yù)處理時(shí)TEER降低明顯。與Hcy組相比，Caco-2細(xì)胞經(jīng)ML-7及PD98059藥物預(yù)處理后TEER下降減緩，F(xiàn)ITC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)

7、量有所降低，MLCK，p-MLCK，Claudin-2蛋白表達(dá)有所降低，ZO-1，Claudin-1，Occludin蛋白表達(dá)有所回升，表明 MEK-ERK-MLCK信號(hào)通路在 Hcy影響Caco-2細(xì)胞通透性的過(guò)程中具有影響。與正常對(duì)照組及TNBS模型對(duì)照組相比，TNBS模型+Hcy皮下注射組DAI，HI，MPO顯著升高，結(jié)腸 MLCK水平明顯增加，大鼠小腸組織中MEK，ERK，p-ERK, MLCK, p-MLCK, Claudin