轉(zhuǎn)錄因子Gln3、Stp1調(diào)控白念珠菌自噬及耐受雷帕霉素的機制研究.pdf

1、白念珠菌是臨床免疫力低下患者最容易感染的一種條件致病菌，且致死率極高，這與白念珠菌在宿主內(nèi)的高適應性有關(guān)。而且這種高適應性也使白念珠菌極易產(chǎn)生耐藥性，這也是臨床上對白念珠菌感染治療失敗的主要原因之一。已有的研究表明，白念珠菌在宿主體內(nèi)的高適應性與其染色體、基因組的不穩(wěn)定性，生物被膜的形成，形態(tài)的改變等密切相關(guān)。但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的機制也難以完全解釋白念珠菌的高適應性和高耐藥性。
　　近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，不同的轉(zhuǎn)錄因子參與了對白念珠

2、菌適應性和耐藥性的調(diào)控。本課題擬利用白念珠菌轉(zhuǎn)錄因子缺失菌庫，篩選發(fā)現(xiàn)調(diào)控白念珠菌適應性和耐藥性的新的轉(zhuǎn)錄因子，并研究其機制。因此，本課題利用48株白念珠菌轉(zhuǎn)錄因子缺失菌，篩選其對不同抗真菌藥物、化合物、以及酸堿、滲透壓等不同刺激的敏感性，發(fā)現(xiàn)了一批可能影響白念珠菌不同表型的轉(zhuǎn)錄因子。
　　其中Gln3△/△和Stp1△/△對雷帕霉素高度耐受，而雷帕霉素結(jié)合蛋白TOR是白念珠菌自噬調(diào)控通路中的關(guān)鍵蛋白，因此推測，這兩個轉(zhuǎn)錄因子可能

3、參與了對白念珠菌自噬的調(diào)控。細胞自噬是真核細胞在饑餓應答及分化等過程中發(fā)生的適應性反應，已成為近年來的研究熱點，但目前鮮見對白念珠菌自噬的研究。因此，本課題利用上述基因缺失菌，研究Gln3和Stp1是否參與調(diào)控白念珠菌自噬，并考察其可能的調(diào)控機制。
　　已有研究表明，在正常培養(yǎng)條件下，細胞內(nèi)存在胞質(zhì)定向液泡通路（CVT通路），該通路與自噬發(fā)生的過程存在著相似性，并且有研究發(fā)現(xiàn)，CVT通路缺陷的菌體，其自噬通路也存在缺陷。在CVT通

4、路和自噬通路缺陷的菌體中，由于自噬小體與液泡融合受阻，細胞表面部分區(qū)域會呈現(xiàn)圓形凹陷。因此本實驗利用干涉相差顯微鏡(DIC)觀察比較YPD培養(yǎng)基中Gln3△/△、Stp1△/△和親本菌SN250的細胞表面，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)親本菌SN250和Gln3△/△的細胞的表面有圓形凹陷，而Stp1△/△的大部分細胞表面呈圓形凹陷，表明Stp1△/△的CVT通路缺陷。而經(jīng)RAPA誘導后，Gln3△/△和Stp1△/△的大部分細胞表面呈圓形凹陷，而SN2

5、50表面凹陷的細胞較少。表明Gln3△/△和Stp1△/△存在自噬缺陷。
　　自噬的發(fā)生通常由自噬相關(guān)基因(ATG)的表達增高引起。因此，本課題通過Realtime-PCR檢測了不同ATG在mRNA水平上的表達情況，發(fā)現(xiàn)RAPA的確能夠使菌體TOR1、ATG等自噬相關(guān)基因的表達升高，而且大部分基因的升高幅度達10倍以上，Gln3△/△和Stp1△/△兩株缺失菌在RAPA作用后，上述自噬相關(guān)基因雖然也能升高，但升高幅度只在2～3倍左

6、右。上述結(jié)果表明，RAPA不能有效誘導Gln3△/△和Stp1△/△中的自噬相關(guān)基因的表達，所以使上述缺失菌出現(xiàn)自噬缺陷。
　　為了進一步考察驗證Gln3和Stp1對白念珠菌自噬的調(diào)控作用，本課題構(gòu)建了Gln3△/△+AB和Stp1△/△+AB兩株轉(zhuǎn)錄因子缺失菌的基因回復菌，并對其基因型進行了鑒定。同時考察回復菌對雷帕霉素（RAPA）的敏感性，發(fā)現(xiàn)Gln3△/△+AB對RAPA的敏感性增加，但Stpl△/△+AB并對RAPA的敏感

7、性并沒有增加，這有可能與異位單拷貝基因回復有關(guān)。
　　液泡蛋白氨基肽酶(API)被認為是CVT通路的標志性蛋白。當營養(yǎng)充足時，胞質(zhì)中的50kD的API前體通過CVT通路運向液泡，在液泡中活化，轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腁PI。但處于有限營養(yǎng)或饑餓環(huán)境時，API主要通過自噬小體運向液泡。因此，在營養(yǎng)充足時，可以通過定位GFP標記的API是否進入液泡，來考察CVT通路是否缺陷。
　　經(jīng)過構(gòu)建API和綠色熒光蛋白融合蛋白表達菌體(GFP-API

8、)，可以定位觀察API在細胞內(nèi)的定位情況。在RAPA作用后，同時，也觀察到Gln3△/△和Stp1△/△胞漿及液泡邊緣明顯存有API前體，并未進入液泡。由于上述結(jié)果表明Stp1△/△中Cvt通路缺陷，對此結(jié)果用western-blot在蛋白水平進行驗證API-GFP前體蛋白的是否被降解，Western結(jié)果表明，Stp1△/△中有80kD的未成熟的API-GFP前體蛋白。這說明轉(zhuǎn)錄因子Stp1調(diào)控CVT通路基因表達，轉(zhuǎn)錄因子Stp1缺失，

9、Cvt通路缺陷。并且轉(zhuǎn)錄因子Gln3和Stp1調(diào)控白念珠菌自噬，轉(zhuǎn)錄因子Gln3和Stp1缺失，自噬缺陷。具體的分子調(diào)控機制有待進一步研究。
　　誘導自噬發(fā)生常通過氮饑餓方式，利用缺氮培養(yǎng)基SD-N(含Arg)同時誘導親本菌SN250和基因缺失菌Gln3△/△和Stp1△/△，基因回復菌Gln3△/△+AB和Stp1△/△+AB自噬。在點板實驗中SD-N培養(yǎng)基上生長并無差異，但是，當在加入RAPA后，增強了其在缺氮培養(yǎng)基上的生存能

10、力。另外，在SD-N(含Arg)誘導的自噬中，發(fā)現(xiàn)以上5株實驗菌株中，液泡內(nèi)均有自噬小體。這說明，Gln3△/△和Stp1△/△能夠在氮源誘導的情況下發(fā)生自噬。在SD-N(含Arg)培養(yǎng)基中觀察API定位情況的實驗中發(fā)現(xiàn)，與其余4株實驗菌體相比，在Gln3△/△液泡內(nèi)僅有少部分成熟的API。我們繼續(xù)對5株實驗菌體對SD-N(含Arg)的耐受性進行考察，發(fā)現(xiàn)Gln3△/△明顯對氮饑餓較為敏感。綜上結(jié)果說明，轉(zhuǎn)錄因子Gln3參與調(diào)控自噬，轉(zhuǎn)

11、錄因子Gln3在參與調(diào)控SD-N誘導的自噬中起著重要的作用，并且可能對增強自噬起到正調(diào)控作用。
　　研究至此，明顯發(fā)現(xiàn)，以上實驗菌珠被SD-N(含Arg)誘導的自噬表型，與RAPA誘導的自噬表型并不相同。所以，我們試圖找出菌體耐受RAPA的調(diào)控機制。以上5株實驗菌株經(jīng)RAPA誘導后，胞內(nèi)ATP均增加。所以推測是有氧呼吸產(chǎn)生ATP環(huán)節(jié)，在耐受RAPA中起著重要的作用。因此，將全營養(yǎng)培養(yǎng)基YPD中的葡萄糖更換成檸檬酸、甘油等需通過不同

12、呼吸方式產(chǎn)生ATP并加以利用的碳源。結(jié)果顯示，以上5株實驗菌體在檸檬酸替換YPD中的葡萄糖培養(yǎng)基中，對RAPA誘導產(chǎn)生了抗性。在三羧酸循環(huán)(TCA)中，丙酮酸羧化酶將丙酮酸羧化后形成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰輔酶A經(jīng)檸檬酸合酶催化后形成檸檬酸。首先，推測可能是檸檬酸的合成受阻。根據(jù)以上研究結(jié)果，我們推測RAPA誘導的自噬中，Gln3△/△和，Stp1△/△發(fā)生自噬缺陷，使得三羧酸循環(huán)(TCA)中檸檬酸合酶不能進入液泡內(nèi)進行降解，使得菌體不

13、斷產(chǎn)生ATP加以利用，從而對RAPA產(chǎn)生了耐藥性。經(jīng)過構(gòu)建檸檬酸合酶(CIT1p)綠色熒光融合蛋白GFP-CIT1p菌體，觀察CIT1p定位發(fā)現(xiàn)，在RAPA誘導后的以上5株實驗菌株中，Gln3△/△、Stp1△/△和Stp1△/△+ AB中的CIT1p位于液泡外部，而液泡內(nèi)并不存在。所以，初步驗證了我們的推測，RAPA誘導的自噬中，Gln3△/△和Stp1△/△自噬缺陷，使得三羧酸循環(huán)(TCA)中檸檬酸合酶不能進入液泡內(nèi)進行降解，使得菌