應(yīng)用微陣列比較基因組雜交研究白念珠菌耐受氧化應(yīng)激的機(jī)制.pdf

1、白念珠菌是威脅人類健康和生命的重要致病真菌，宿主主要通過(guò)吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)殺傷白念珠菌，白念珠菌對(duì)氧化損傷的耐受可以導(dǎo)致其免疫逃逸，進(jìn)一步促進(jìn)感染的形成。因此深入研究白念的氧化應(yīng)激機(jī)制意義重大。 目的： 本課題的研究對(duì)象是對(duì)氧化應(yīng)激耐受性存在顯著差異的臨床白念珠菌，通過(guò)考察這些白念珠菌的基因組特征，尋找氧化應(yīng)激耐受性形成的關(guān)鍵基因組區(qū)域和關(guān)鍵基因，力圖從基因組水平闡述白念珠菌氧化應(yīng)激耐受性的形成機(jī)制，為深入

2、研究白念珠菌氧化應(yīng)激機(jī)制提供新思路和線索。 方法： 本研究第一部分，以過(guò)氧化氫模擬氧化應(yīng)激環(huán)境，從臨床白念珠菌菌庫(kù)中篩選獲對(duì)氧化應(yīng)激耐受性存在差異的白念珠菌，通過(guò)初篩及多種實(shí)驗(yàn)方法確證，獲取芯片雜交實(shí)驗(yàn)菌株。 第二部分，我們通過(guò)制備白念珠菌全基因組寡核苷酸芯片，應(yīng)用微陣列比較基因組雜交技術(shù)，考察了白念珠菌的基因組特征。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)芯片雜交結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)用聚類分析，對(duì)芯片雜交結(jié)果進(jìn)行聚類。通過(guò)Cluste

3、r-Miner軟件對(duì)得到的基因拷貝數(shù)變化信息進(jìn)行染色體定位。運(yùn)用SAM統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選與白念珠菌耐受氧化應(yīng)激密切相關(guān)的基因。通過(guò)檢索念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)得到的各項(xiàng)結(jié)果進(jìn)行分析總結(jié)。 結(jié)果： 通過(guò)初篩，發(fā)現(xiàn)臨床白念珠菌存在氧化應(yīng)激耐受力的差異，通過(guò)各種方法的確證最終獲得了芯片雜交的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，3株過(guò)氧化氫耐受菌和3株過(guò)氧化氫敏感菌。 芯片雜交聚類結(jié)果顯示，對(duì)氧化應(yīng)激耐受性不同的白念珠菌分別屬于不同的聚類，從而確信了白

4、念珠菌對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性具有一定的基因組特征。通過(guò)SAM篩選獲得122個(gè)差異基因，其中多個(gè)線粒體相關(guān)基因在耐受過(guò)氧化氫菌株中高拷貝。白念珠菌生長(zhǎng)狀態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，沒(méi)有看到生長(zhǎng)狀態(tài)與氧化應(yīng)激間的關(guān)系。通過(guò)對(duì)得到的基因拷貝數(shù)變化信息進(jìn)行染色體定位，初步確定了兩個(gè)差異片段，一個(gè)位于白念珠菌4號(hào)染色體，一個(gè)位于白念珠菌R染色體。實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，4號(hào)染色體上的差異片段有兩個(gè)相鄰基因同時(shí)缺失。 結(jié)論： 通過(guò)微陣列比較基因組雜