日本對蝦MCM7克隆及其調(diào)控細胞吞噬作用的研究.pdf

1、Z h e j i a n g A & F U n i v e r s i t yD i s s e r t a t i o n f o r t h e D e g r e e o f M a s t e rM o l e c u l a r c l o n i n g o f K u r u m a s h r i m p M a r s u p e n a e u s j a p o n i c u sM i n i c h

2、 r o m q ‘t e n a n c e p r o t e i n 7 r M C M 7 ) a n dt h e N i l n i c I I r o m o s o m em a i n t e n a n c e o r o t e i n 7 a n d t h e IJ ⅥC J Ⅵ’7 le x p l o r a t i o no f i t sr e g u l a t i o n o nh e m o l

3、y m p h p h a g o c y t o s eC a n d i d a t e ：Z h iW a n gA d v i s e r ：F e iZ h uS p e c i a l i t y ：A n i m a l b r e e d i n gD a t eo f S u b m i s s i o n ：D e c e m b e r 2 1 ，2 0 1 5Z h e j i a n g A & F U

4、 n i v e r s i t yL i n ’a n ，Z h e j i a n gp r o v i n c e ，P ．R ．C h i n aD e c e m b e r 2 1 ，2 0 1 5／摘要摘要微染色體維持蛋I 芻( M i n i c h r o m o s o m eM a i n t e n a n c eP r o t e i n ，M C M 7 ) 隸屬于M C M 蛋白家族，在真核生物中高度保守，

5、參與M C M s 復(fù)合體作為細胞復(fù)制周期的許可證和染色體復(fù)制起始因子。使用c D N A 末端快速擴增技術(shù)( R a p i d A m p l i f i c a t i o no f e D N A E n d s ，R A C E ) 從日本對蝦( M a r s u p e n a e u sJ a p o n i c u s ) d ? 克隆得到全長為2 3 0 7 b p 的e D N A 序列，分析顯示該基因擁有1 9

6、7 4 b p 大小的開放閱讀框，編碼一個6 5 8 a a 蛋白，基因含有P o l y( A ) 尾，5 ’和3 ’的非編碼區(qū)分別為1 3 9 b p 和1 9 1 b p ，蛋白序列B L A S T 發(fā)現(xiàn)同源性高于7 5 ％，進化樹分析顯示該基因在真核動物中高度保守，與魚類與爪蟾享有較近親緣關(guān)系。檢測基因表達的組織特異性發(fā)現(xiàn)M C M 7 表達在免疫器官包括血淋巴及肝胰腺中較高，消化腺內(nèi)表達水平次之，而在心臟、肌肉、鰓和后腸等組

7、織內(nèi)表達量較低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，感染對蝦白班綜合征病毒( W h i t eS p o t S y n d r o m e V i r u s ，w s s v ) 后，M C M 7 基因出現(xiàn)過表達。通過小R N A 干擾技術(shù)( S h o r t I n t e r f e r i n gR N A ，s i R N A ) ，設(shè)計并體外合成的s i R N A 注射處理對蝦，成功敲低M C M 7 的表達。實時熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)基因

8、表達水平降低后，對蝦先天性免疫系統(tǒng)中多個重要基因受到影響，其中h e m o c y a n i n ，p r o P O ，T N F 和p - a c t i n 的表達量上調(diào)，而細胞骨架蛋白調(diào)控基因如m y o s i n ，R h o 的表達量則下調(diào)，則表明M C M 7 的表達對細胞吞噬作用有影響。通過I ⅢA i 技術(shù)抑制M C M 7 表達后，發(fā)現(xiàn)細胞吞噬率降低，表明M C M 7 對細胞吞噬有調(diào)控作用。并且M C M 7