氨茶堿干預(yù)A549細(xì)胞吞噬凋亡嗜酸粒細(xì)胞的研究.pdf

1、背景： 嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)是支氣管哮喘發(fā)病中的重要表現(xiàn)，而嗜酸粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸影響著哮喘病情的轉(zhuǎn)歸。細(xì)胞死亡的途徑有兩種：一是死亡，另一是凋亡。其中細(xì)胞凋亡因?yàn)榧?xì)胞膜的完整可以使致炎物質(zhì)不外泄。細(xì)胞凋亡后因?yàn)橐幌盗械鞍自诩?xì)胞膜上的表達(dá)可以被吞噬細(xì)胞吞噬。因此凋亡的嗜酸粒細(xì)胞被具有吞噬功能的氣道上皮細(xì)胞吞噬可以減輕支氣管哮喘中氣道的炎性反應(yīng)。 氨茶堿是治療支氣管哮喘有效的藥物，近年的實(shí)驗(yàn)及研究表明，氨茶堿除具有舒張支氣管的作用外，

2、還有免疫和抗炎的作用。 已有文獻(xiàn)報(bào)道地塞米松可以上調(diào)上皮細(xì)胞吞噬凋亡的嗜酸粒細(xì)胞的能力，并存在濃度依賴效應(yīng)。對(duì)同為治療支氣管哮喘有效的藥物，對(duì)于氨茶堿是否可以干預(yù)上皮細(xì)胞，進(jìn)而影響其吞噬凋亡的嗜酸粒細(xì)胞的能力還不清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道氨茶堿可以抑制一些炎性因子的分泌，但氨茶堿對(duì)上皮細(xì)胞吞噬凋亡的嗜酸粒細(xì)胞的干預(yù)作用是否與抑制炎性因子的分泌相關(guān)還未見(jiàn)報(bào)道。因此研究氨茶堿對(duì)上皮細(xì)胞吞噬凋亡的嗜酸粒細(xì)胞干預(yù)的作用及對(duì) IL-6、IL-8分泌

3、的影響，對(duì)研究氨茶堿的在治療支氣管哮喘中的作用及研究其抗炎作用的新思路有著重要的意義，并能為支氣管哮喘臨床治療提供新的依據(jù)。 目的： 1、構(gòu)建A549細(xì)胞吞噬凋亡的嗜酸粒細(xì)胞的模型，為進(jìn)一步研究氨茶堿對(duì)上皮細(xì)胞吞噬凋亡的嗜酸粒細(xì)胞干預(yù)的作用提供細(xì)胞模型。 2、以A549細(xì)胞吞噬凋亡的嗜酸粒細(xì)胞的模型為基礎(chǔ)，研究氨茶堿對(duì)A549細(xì)胞吞噬能力的干預(yù)作用。并了解有無(wú)濃度依賴和時(shí)間依賴的關(guān)系。 3、研究氨茶堿對(duì)由

4、脂多糖及凋亡的嗜酸粒細(xì)胞分別刺激后的A549細(xì)胞分泌的炎性因子有無(wú)抑制作用，是否存在濃度依賴關(guān)系。 4、氨茶堿對(duì)上皮細(xì)胞吞噬凋亡的嗜酸粒細(xì)胞干預(yù)的作用與抑制炎性因子的分泌的作用是否相關(guān)。 方法: 通過(guò)培養(yǎng)獲得持續(xù)傳代的 A549 細(xì)胞，將不同濃度的氨茶堿(0、10<'-3>、10<'-4>、10<'-5>mol/L)在吞噬實(shí)驗(yàn)前24、48、72小時(shí)加入到A549細(xì)胞中；采用磁細(xì)胞分離柱(MACS Column)、

5、CD16磁珠抗體、CD15的磁珠抗體分離純化人外周血嗜酸粒細(xì)胞，體外培養(yǎng)48小時(shí)后自然老化，通過(guò)形態(tài)學(xué)和AnnexinV-FITC試劑盒進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞凋亡鑒定，再加入到已用氨茶堿干預(yù)后的A549細(xì)胞中，使用鄰聯(lián)茴香胺對(duì)吞噬的凋亡嗜酸粒細(xì)胞進(jìn)行過(guò)氧化物酶染色，再將A549細(xì)胞用蘇木素加以核襯染。運(yùn)用Olympus倒置顯微鏡及Diagnostic Instruments-Spot insigh數(shù)字圖象采集攝像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察A549細(xì)胞吞噬凋

6、亡嗜酸粒細(xì)胞現(xiàn)象，并在光鏡下對(duì)已固定染色的細(xì)胞進(jìn)行吞噬率統(tǒng)計(jì)。另將不同濃度的氨茶堿(0，10<'-3>，10<'-4>，10<'-5>mol/L)分別干預(yù)A549細(xì)胞、A549與凋亡的嗜酸粒細(xì)胞、A549與脂多糖，收獲培養(yǎng)后的上清液，采用放射免疫法檢測(cè)白細(xì)胞介素IL-6和IL-8的濃度。 結(jié)果 1、A549細(xì)胞分別被氨茶堿干預(yù)24、48、72小時(shí)后，A549細(xì)胞吞噬能力隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯下降。 2、A549細(xì)胞在氨茶

7、堿以10<'-3>mol/L 濃度干預(yù)時(shí)的吞噬能力最低，10<'-4>mol/L、10<'-5>mol/L 時(shí)的吞噬能力明顯升高。 3、吞噬了凋亡嗜酸粒細(xì)胞后A549細(xì)胞與未吞噬的A549細(xì)胞相比，IL-6、IL-8分泌沒(méi)有顯著差異。但較脂多糖刺激 A549 細(xì)胞后IL-6、IL-8的分泌值明顯降低。 4、氨茶堿可以抑制脂多糖刺激A549細(xì)胞后IL-6、IL-8的分泌且存在濃度依賴關(guān)系。 結(jié)論 1、氨茶堿