BMP-2誘導成骨分化過程與Wnt-β-catenin通路的串話機制研究.pdf

1、背景:基因治療和組織工程是目前研究解決骨損傷和骨疾病的熱門領域和具有希望前景的手段。間充質干細胞因其成骨特性和潛能成為為骨再生和骨組織工程的種子細胞和基本要素。BMP-2的基因轉染能有效的治愈骨折骨缺損。多種細胞信號通路參與骨細胞的分化、增殖和代謝維持并存在相互協(xié)調或調節(jié)的影響，其中BMP信號通路和Wnt信號通路在骨的發(fā)生和發(fā)展中均起著關鍵性作用，由于兩者信號通路的復雜的分子基礎和信號網絡，它們在骨形成過程中的作用更為復雜和多樣，具體詳

2、細的“串話”機制仍不明了。了解其中的關鍵機制將有助于骨相關疾病的藥物靶點治療和基因治療。
　　目的:(1)本研究通過使用攜帶rhBMP-2基因的質粒轉染小鼠間充質干細胞(C3H101/2)研究pCDNA3.1-rhBMP-2基因重組質粒的成骨效應和C3H101/2的成骨活性;(2) BMP-2能否上調和激活Wnt/β-catenin通路中已經明確的關鍵因子;(3)探討B(tài)MP-2/Smad信號通路對在Wnt/β-catenin通路的

3、交互可能作用機制和方式，試尋其中可能關鍵調節(jié)因子，為今后骨相關疾病的基因治療和藥物靶點治療提供理論和實驗基礎。
　　一、rhBMP-2基因轉染小鼠間充質干細胞C3H10T1/2的成骨活性和增殖能力研究
　　方法:在本實驗第一部分主要通過以下幾種實驗手段和技術完成研究。(1)通過已構建的研究pCDNA3.1-rhBMP-2基因重組質粒轉染 C3H10T1/2細胞，利用質粒本身攜帶的G418抗藥性對轉染的細胞進行篩查，明確轉染是

4、否成功。(2)觀察pCDNA3.1質粒進行基因轉染后對細胞上清液中的BMP-2含量的變化，進行ELISA檢測，從中觀察BMP-2的釋放機制和水平。(3)使用CCK-8試劑盒對轉染pCDNA3.1-rhBMP-2基因重組質粒的細胞進行增值活性的檢測。(4)隨后對C3H10T1/2細胞成骨分化進行檢測，檢測其ALP活性并進行ALP染色和茜素紅鈣結節(jié)染色了解其中成骨活性，了解其成骨強度變化。
　　結果:(1)BMP-2 ELISA結果顯

5、示:轉染組BMP-2濃度升高并維持在較高水平并且均明顯高于空白組和空載組(p＜0.05)。(2)轉染組的增殖趨勢最明顯，細胞數(shù)量隨時間增加而增加，其中細胞在第4d至第8d增殖最快，第8d后逐漸進入平臺期。(3)ALP檢測結果顯示，轉染組在第7d至第21d增加最明顯，第21d達到高峰（P＜0.05）。(4)轉染組兩種ALP染色和茜素紅鈣結節(jié)染色均比空載組和空白組有較深的陽性結果。
　　結論:(1)pcDNA3.1/rhBMP-2重組

6、質粒是一種廉價、安全有效的轉染方式，能在一定時間內平穩(wěn)和持續(xù)的高表達外源性BMP-2。(2)C3H10T1/2細胞是pcDNA3.1/rhBMP-2重組質粒的良好宿主，能成骨表達外源性BMP-2。(3)BMP-2是有效骨誘導劑，能促進細胞的增殖和誘導間充質干細胞成骨分化，促進鈣的沉積。
　　二、BMP與Wnt信號通路串話作用在間充質干細胞成骨作用的研究
　　方法:在第二部分中我們采用Western-blot和RT-PCR方法

7、檢測BMP-2誘導C3H10T1/2細胞分化成骨細胞過程中Wnt/β-catenin通路中關鍵細胞因子β-eatenin、pβ-catenin、RUNX2、LEF1的表達情況，探討這些關鍵因子在BMP-2誘導成骨分化過程中的作用。同時檢測BMP-2/Smad信號通路中重要的調解因子Smurf-2水平和β-catenin關鍵的胞漿內結構穩(wěn)定因子Axin、GSK3β，探討Smurf-2對β-catenin的可能影響機制。
　　結果:在

8、BMP-2誘導成骨細胞分化的過程中，轉染組增加β-catenin mRNA的表達和促進β-catenin蛋白磷酸化水平（t=7.609，p=0.002）。轉染組上調Wnt/β-catenin通路中的重要轉錄因子LEF1的mRNA表達和蛋白合成（t=4.256，p=0.013）。在BMP-2誘導的成骨細胞分化中，Smurf-2mRNA表達和蛋白表達相對于對照組少（t=7.609,p=0.013）。轉染BMP-2基因后能明顯上調提高BMP-

9、2mRNA，而對細胞內β-catenin降解復合體GSK3β-APC-Axin2的表達起下調作用。
　　結論:在探討B(tài)MP信號通路和Wnt/β-catenin通路在成骨細胞分化過程中的串話機制中，我們發(fā)現(xiàn)成骨分化過程中BMP信號通路與Wnt/β-catenin通路存在串話機制。(1)BMP-2能上調Wnt/β-catenin通路中關鍵細胞因子β-catenin、pβ-catenin、RUNX2、LEF1的表達，參與Wnt/β-ca